【摘要】：腫瘤是生長于靶器官卻與其不相協(xié)調(diào)的組織團(tuán)塊的異常增生,惡性腫瘤由于其細(xì)胞可侵犯、浸潤?quán)徑M織細(xì)胞,并能通過血液或淋巴系統(tǒng)從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到其他組織形成新的瘤塊的特點(diǎn),導(dǎo)致其難以治愈。傳統(tǒng)的治療手段均存在對(duì)機(jī)體損傷大、風(fēng)險(xiǎn)高、易于復(fù)發(fā)的問題,而基因治療由于其獨(dú)特的切入點(diǎn)為癌癥的根治帶來了希望�；蛑委熓菑姆肿訉用嫒胧�,通過特殊傳遞系統(tǒng)將目的基因遞送至靶細(xì)胞,而目前基因治療的瓶頸則是尋求合適有效的基因載體系統(tǒng)。相較于免疫原性高、制備復(fù)雜的病毒載體,非病毒載體由于其細(xì)胞毒性低、易于制備、無感染和惡化風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢受到研究者的青睞,其中陽離子聚合物聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI),由于其獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”和良好的轉(zhuǎn)染效率,近年來研究較多。但PEI單獨(dú)使用時(shí)存在體液穩(wěn)定性差、高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性不相兼得、無腫瘤特異靶向性等問題。由此,本課題組嘗試以細(xì)胞毒性低的支鏈型PEI 2kDa為骨架,用天然高分子材料殼聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,構(gòu)建PEI衍生物,以期在降低細(xì)胞毒性、增加生物相容性的同時(shí)確保高的轉(zhuǎn)染效率;再連接雙功能肽t Lyp-1—NLS(命名為K12),增加聚合物腫瘤細(xì)胞靶向性,進(jìn)一步提高載體轉(zhuǎn)染效率。本文第一章介紹了聚乙烯亞胺、殼聚糖單獨(dú)作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用及缺陷,說明先對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性再對(duì)聚乙烯亞胺進(jìn)行修飾的必要性;短肽t Lyp-1能與腫瘤新生血管及細(xì)胞膜上高表達(dá)的NRPs受體特異結(jié)合,NLS是核定位信號(hào)肽,可促進(jìn)細(xì)胞核遞送,進(jìn)一步靶向于細(xì)胞亞結(jié)構(gòu),依此提出設(shè)想,嘗試構(gòu)建新型雙功能肽,再將其連接聚乙烯亞胺衍生物上,以期構(gòu)建轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、有腫瘤細(xì)胞靶向性的新型轉(zhuǎn)基因載體。第二章講述了本課題設(shè)想的新型轉(zhuǎn)基因載體的具體構(gòu)建方法:首先通過硼氫化鉀、N-甲基吡咯烷酮等對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性,構(gòu)建季銨化殼聚糖OTMCS,再通過N-羥基琥珀酰亞胺將其連接到支鏈型PEI 2kDa上,通過固相法合成雙功能肽K12,最后通過SMCC法將前體PEI衍生物與K12連接,構(gòu)建載體OTMCS-PEI-K12,并通過控制K12的投料比,構(gòu)建低、中、高功能肽比例的聚合物,分別命名為OTMCS-PEI-K12-2,OTMCS-PEI-K12-5,OTMCS-PEI-K12-10。通過質(zhì)譜、HPLC、1H-NMR對(duì)聚合物的合成情況進(jìn)行表征,發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物被成功合成,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第三章通過體外實(shí)驗(yàn),考察不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12的理化性質(zhì):通過酸堿滴定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過OTMCS和K12修飾的PEI,緩沖能力有所減弱,但相較于生理鹽水,仍表現(xiàn)出良好的緩沖效果;通過瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)考察OTMCS-PEI-K12包合DNA能力,發(fā)現(xiàn)2、5、10倍K12投料比的OTMCS-PEI-K12分別能在w/w為0.8,1.2,1.6時(shí)將DNA完全縮合,且可以抵抗至少50 U DNase I/μg DNA和200μg/mL的肝素鈉的解離;通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn),聚合物OTMCS-PEI-K12單體呈現(xiàn)枝椏蓬松狀,結(jié)合DNA后,復(fù)合物OTMCS-PEI-K12/DNA呈結(jié)構(gòu)緊密的橢圓形,且納米粒子分散系均一、穩(wěn)定,通過粒度-電位儀檢測,發(fā)現(xiàn)在復(fù)合物質(zhì)量比為5—30之間時(shí),OTMCS-PEI-K12/DNA粒徑約為100—600nm,Zeta電位約為1—36m V;通過MTT、水解實(shí)驗(yàn)考察OTMCS-PEI-K12的細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示,即使在高濃度下,OTMCS-PEI-K12仍表現(xiàn)出低的細(xì)胞毒性低,且能在60h后水解為小分子,有良好的生物降解性。第四章通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),考察了OTMCS-PEI-K12的轉(zhuǎn)染能力,并通過在細(xì)胞系中添加不同抑制劑,初步探究聚合物的胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制:選用B16和U87細(xì)胞系,以綠色熒光蛋白pEGFP-N2和蟲熒光素酶pGL3-Control為報(bào)告基因,選用PEI 25kDa作為陽性對(duì)照,結(jié)果顯示,PEI 2kDa轉(zhuǎn)染效率明顯低于PEI 25kDa,但隨著OTMCS、K12的逐步修飾,聚合物轉(zhuǎn)染效率逐漸增強(qiáng),在相同質(zhì)量比下,新合成的載體OTMCS-PEI-K12轉(zhuǎn)染效果好于PEI 25kDa;OTMCS-PEI-K12在不同細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染效果不同,其在U87中的轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于B16;不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12在U87中轉(zhuǎn)染效果有所差異,相同條件下,OTMCS-PEI-K12-5轉(zhuǎn)染效果最好。通過在細(xì)胞系中添加微管、微絲、Dynein抑制劑考察胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況發(fā)現(xiàn):微管的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)OTMCS-PEI-K12影響不大,而當(dāng)胞內(nèi)微絲、Dynein受到抑制時(shí),OTMCS-PEI-K12的轉(zhuǎn)染受到抑制,且隨抑制劑濃度增大,轉(zhuǎn)染效率降低,說明OTMCS-PEI-K12是受體介導(dǎo)的特異性胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),適宜機(jī)體中非分裂分化細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。第五章在前期研究基礎(chǔ)上,選擇體外轉(zhuǎn)染效果最好的OTMCS-PEI-K12-5作為載體,以ING4為治療基因,通過構(gòu)建U87無胸腺小鼠腫瘤模型,采用尾注、瘤注兩種給藥方式,考察不同質(zhì)量比載藥復(fù)合物OPK5/DNA的腫瘤組織靶向性及治療能力。結(jié)果表明,通過尾靜脈給藥且復(fù)合物OPK5/DNA在w/w=12時(shí),目的基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長的效果最好,說明OPK5有U87腫瘤細(xì)胞靶向性能。綜上,本課題成功構(gòu)建新型陽離子聚合物OTMCS-PEI-K12,理化試驗(yàn)和體內(nèi)、外轉(zhuǎn)染結(jié)果表明,OTMCS-PEI-K12可兼得低的細(xì)胞毒性和高的轉(zhuǎn)染效率,擁有良好的生物相容性、U87腫瘤細(xì)胞靶向性和體液穩(wěn)定性,適宜作為轉(zhuǎn)基因材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.5;TB383.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2245731