本文選題：生物傳感器 + 核酸探針��； 參考：《湖南大學》2015年博士論文

【摘要】：現(xiàn)代社會的快速發(fā)展對分析化學,特別是對生化分析提出了更高的要求,發(fā)展新的分析方法和技術(shù)以解決越來越多的分析難題和社會熱點問題為分析化學科研工作者提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。近年來,生物傳感技術(shù)因其靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)速度快、檢測成本低等優(yōu)點,為生物醫(yī)學和分析化學領(lǐng)域的研究提供了新的思路和技術(shù)支持,極大地推動了生物醫(yī)學、臨床診斷和藥物篩選的發(fā)展。此外,光學檢測技術(shù)因其具有操作簡便、響應(yīng)速度快、易于實現(xiàn)等優(yōu)點,在生化分析領(lǐng)域受到了廣大研究者的關(guān)注。本論文結(jié)合功能核酸分子探針、納米材料和光學檢測技術(shù)的優(yōu)勢,建立了一些生物傳感新方法用于堿基切除修復(fù)酶活性及其抑制劑、p H、核酸、小分子、micro RNA表達水平的分析與測定。和傳統(tǒng)方法相比,本論文建立的分析方法操作簡便、靈敏度高、選擇性好、分析速度快,并通過對實際樣品的分析,初步驗證了這些方法的實用性。具體內(nèi)容如下:DNA損傷的修復(fù)在保持基因完整性中起著重要作用,堿基切除修復(fù)作為保護細胞免受DNA損傷影響的主要途徑之一,其修復(fù)酶的活性和多種疾病相關(guān)。第2章中,以尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)為目標分析模型,基于雜交鏈式放大反應(yīng)和氧化石墨烯的熒光淬滅能力,建立了一種無酶參與的循環(huán)放大策略用于堿基切除修復(fù)酶的高靈敏檢測。UDG能夠切除發(fā)夾探針的尿嘧啶堿基并產(chǎn)生脫堿基位點,降低了發(fā)夾探針的熔鏈溫度,導致發(fā)夾探針結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,釋放出單鏈,從而引發(fā)雜交鏈式反應(yīng),利用氧化石墨烯區(qū)分單雙鏈以及較強的熒光淬滅能力,實現(xiàn)了對UDG的高靈敏檢測。該方法具有較寬的動態(tài)響應(yīng)范圍和較低的檢測限,其線性檢測范圍為0.0001-100 U/m L,檢測下限為0.00006 U/m L。此外,該方法也被成功用于UDG抑制劑的測定,并且還適用于復(fù)雜體系中UDG活性的測定。本方法設(shè)計簡單、靈敏度高且選擇性好,有望為UDG活性分析和相關(guān)的生物學研究提供一個低成本、高靈敏的均相分析檢測平臺。細胞內(nèi)p H是細胞生理活動中的重要調(diào)控因子之一,p H的檢測在研究生理和病理過程中具有重要作用。第3章中,基于不同p H條件下會導致DNA構(gòu)象的變換,以氧化石墨烯為熒光淬滅劑,構(gòu)建了一種簡單、快速的p H分析方法。實驗設(shè)計了一條p H敏感的DNA探針,在酸性條件下,DNA探針以三鏈結(jié)構(gòu)存在于溶液中,而在弱堿性條件下,DNA探針以發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在。由于DNA三鏈結(jié)構(gòu)剛性較強,與氧化石墨烯的結(jié)合力較弱,氧化石墨烯不能有效淬滅標記在DNA探針上熒光染料的熒光,因此得到較強的熒光信號;然而,在弱堿性條件下,氧化石墨烯可以與DNA發(fā)夾的粘性末端結(jié)合,有效地淬滅了DNA探針的熒光,得到較弱的熒光信號,從而實現(xiàn)對p H的快速檢測。生命體中核酸和小分子的研究對生物醫(yī)學和臨床診斷有著非常重要的意義。第4章中,我們利用濕法化學方法合成了石墨烯-血紅素雜化納米片(GHs),并且通過實驗發(fā)現(xiàn),合成的GHs不僅具備過氧化物酶活性,而且具有區(qū)分單雙鏈DNA的能力�；贕Hs的特殊性質(zhì),發(fā)展了一種非標記的比色策略用于核酸和小分子的檢測。該方法操作簡單,成本較低,有望成為核酸和小分子檢測的一種常用方法。Micro RNA是一類內(nèi)源性表達的長度約19-25個核苷酸的非編碼RNA分子,在細胞內(nèi)參與組建沉默復(fù)合物與目標m RNA雜交,通過抑制靶m RNA的降解和蛋白質(zhì)的翻譯實現(xiàn)蛋白表達的調(diào)控。最新研究發(fā)現(xiàn)micro RNA表達水平的變化與許多疾病和癌癥的發(fā)生息息相關(guān),并且其有望成為新的臨床診斷與治療的生物標志物。第5章中,基于甲氧檗因可以與多聚腺苷酸特異性結(jié)合的性質(zhì),利用核酸嵌入染料SYBR Green I作為熒光指示劑,開發(fā)了一種非標記熒光方法用于micro RNA的檢測。甲氧檗因可以和多聚腺苷酸以1:4的比例特異性結(jié)合,形成(腺苷)2-甲氧檗因-(腺苷)2復(fù)合物,因此,它可以將同源的多聚腺苷酸折疊成一條反平行結(jié)構(gòu)的雙鏈。利用poly(A)聚合酶在mi RNA 3′端延伸出一個poly(A)-tail,通過甲氧檗因與poly(A)-tail之間的特異性結(jié)合,將poly(A)-tail折疊成一條反平行結(jié)構(gòu)的雙鏈,經(jīng)SYBR Green I染色后,產(chǎn)生較強的熒光信號,從而實現(xiàn)對目標micro RNA的非標記熒光檢測。第6章中,基于二硫化鎢納米片的熒光淬滅能力,結(jié)合雙鏈特異性核酸酶信號放大策略,提出了一種新型熒光分析方法用于micro RNA的高靈敏檢測。本章首次提出二硫化鎢納米片可以作為一種熒光染料淬滅劑,可以有效的淬滅熒光染料分子的熒光,并且,該納米片對不同長度寡核苷酸片段的吸附作用有著明顯的差異。目標micro RNA與單鏈DNA探針雜交形成DNA/RNA雙鏈結(jié)構(gòu),雙鏈特異性核酸酶可以識別DNA/RNA雜交雙鏈,并且選擇性地將雙鏈中的DNA剪切成短寡核苷酸片段,從而引發(fā)雙鏈特異性核酸酶信號放大反應(yīng)。由于剪切得到的寡核苷酸片段較短,與二硫化鎢納米片之間的吸附作用較弱,從而產(chǎn)生很強的熒光信號,實現(xiàn)對micro RNA的高靈敏檢測。本章發(fā)展的分析方法檢測下限為300 f M,并且具有良好的選擇性,能實現(xiàn)單堿基錯配的良好區(qū)分。該方法為二硫化鎢納米片與核酸信號放大技術(shù)的結(jié)合提供了一個實例,在生物醫(yī)學研究和臨床診斷領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。
[Abstract]:In recent years , the method has the advantages of simple operation , high sensitivity , high response speed , low detection cost and so on . The method has the advantages of simple operation , high sensitivity , high response speed and low detection cost . This method is simple , high in sensitivity and good in selectivity . It is expected to provide a low - cost , high - sensitive homogeneous analysis and detection platform for UDG activity analysis and related biological research . This paper presents a novel fluorescence analysis method for high sensitive detection of micro RNA , which can be used as a fluorescent dye quencher .
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TP212.3;TB383.1

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本文編號：1991207