本文選題：富勒烯納米晶體 + 表達優(yōu)化��； 參考：《華中科技大學》2015年碩士論文

【摘要】：納米材料進入生物體后,會接觸上千種蛋白,引起多種生物學效應甚至產(chǎn)生毒性,其原因主要是納米材料與體內(nèi)細胞、蛋白質等相互作用。納米材料與蛋白質結合后會對其構型、活性和穩(wěn)定性等產(chǎn)生影響,進而改變蛋白結構和功能。富勒烯納米晶體具有獨特的三維共軛結構和物理化學性質,因此在醫(yī)學和生物學領域中極具潛力,其應用包括DNA的光剪切、酶抑制作用、腫瘤治療、藥物載體、抗菌和細胞保護等。研究已表明富勒烯納米晶體(C60)具有與N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受體NR2B亞基相似的功能,通過與鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)發(fā)生特異、穩(wěn)定性相互作用,從而將其鎖定在活化狀態(tài),引發(fā)特定信號傳遞,促進學習與記憶過程。研究納米材料與蛋白質相互作用,將有助于全面了解其作用機理,同時也為其開發(fā)新的醫(yī)學應用及安全性設計提供了重要的理論依據(jù)。本論文主要分為兩個部分:(1)為了提高表達量,將CaMKⅡα蛋白在不同標簽的載體中進行融合表達,并對表達條件進行優(yōu)化。結果表明在pET22b載體中,菌種按0.1%接種量,加入0.2mM IPTG,在16℃條件下誘導16 h表達效果最好。隨后通過親和層析、分子篩等純化操作,以其獲得可溶性的目的蛋白,為后續(xù)實驗提供足夠樣品。(2)通過溶劑置換法制備了C60水懸液,并用UV、DLS對其進行了表征。利用Langmiur平衡吸附等溫模型考察了1μg C60可最大結合5.435μg CaMKⅡα蛋白。DLS結果顯示納米晶體吸附蛋白后以單體形式為主,僅有少量的團聚體。隨后在模擬生理條件下,利用光譜實驗和分子模擬技術研究了不同溫度下C60與CaMKⅡα相互作用結合參數(shù)。結果如下:根據(jù)熒光猝滅原理判斷猝滅機制為靜態(tài)猝滅,并得出在298 K,310 K和318 K三個不同溫度下的結合常數(shù)分別為4.87×105,6.47×105,7.65×105 L·mol-1。通過計算熱力學參數(shù),焓變ΔH為正值(209.805 kJ/mol),熵變ΔS為正值(778.364 J/mol/K)。由此推斷C60與CaMKⅡα結合是靠疏水作用進行的自發(fā)反應,與分子模擬結果一致。分子模擬研究進一步表明,C60主要以π-π鍵形式和蛋白分子中芳香族或帶電殘基結合,是對熱力學實驗很好的補充。紫外光譜和同步熒光光譜結果說明C60可以引起蛋白疏水腔中Trp殘基周圍微環(huán)境的疏水性降低,極性增加。此外,根據(jù)圓二色譜的擬合數(shù)據(jù),定量計算了蛋白分子二級結構,表明C60對蛋白二級結構沒有顯著的影響,僅使α-螺旋降低了1.8%,β-折疊升高了1.1%。
[Abstract]:After the nanomaterials enter into the organism, they will come into contact with thousands of proteins, which will cause many biological effects and even produce toxicity, mainly due to the interaction of nanomaterials with cells, proteins and so on. The structure, activity and stability of nanomaterials are affected by their binding with proteins, and then the structure and function of proteins are changed. Fullerene nanocrystals have a unique three-dimensional conjugate structure and physical and chemical properties, so they have great potential in medical and biological fields. Their applications include DNA photoshear, enzyme inhibition, tumor therapy, drug carriers, etc. Antibacterial and cell protection. It has been shown that fullerene nanocrystalline (C60) has a similar function to the NR2B subunit of N- methyl D- aspartic acid (NMDA) receptor, and it interacts with Ca ~ (2 +) / calmodulin dependent protein kinase 鈪，

本文編號：1810424