發(fā)布時(shí)間：2018-04-27 10:48

  本文選題：富勒烯納米晶體 + 表達(dá)優(yōu)化　； 參考：《華中科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：納米材料進(jìn)入生物體后,會(huì)接觸上千種蛋白,引起多種生物學(xué)效應(yīng)甚至產(chǎn)生毒性,其原因主要是納米材料與體內(nèi)細(xì)胞、蛋白質(zhì)等相互作用。納米材料與蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)對(duì)其構(gòu)型、活性和穩(wěn)定性等產(chǎn)生影響,進(jìn)而改變蛋白結(jié)構(gòu)和功能。富勒烯納米晶體具有獨(dú)特的三維共軛結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì),因此在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中極具潛力,其應(yīng)用包括DNA的光剪切、酶抑制作用、腫瘤治療、藥物載體、抗菌和細(xì)胞保護(hù)等。研究已表明富勒烯納米晶體(C60)具有與N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受體NR2B亞基相似的功能,通過(guò)與鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)發(fā)生特異、穩(wěn)定性相互作用,從而將其鎖定在活化狀態(tài),引發(fā)特定信號(hào)傳遞,促進(jìn)學(xué)習(xí)與記憶過(guò)程。研究納米材料與蛋白質(zhì)相互作用,將有助于全面了解其作用機(jī)理,同時(shí)也為其開(kāi)發(fā)新的醫(yī)學(xué)應(yīng)用及安全性設(shè)計(jì)提供了重要的理論依據(jù)。本論文主要分為兩個(gè)部分:(1)為了提高表達(dá)量,將CaMKⅡα蛋白在不同標(biāo)簽的載體中進(jìn)行融合表達(dá),并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明在pET22b載體中,菌種按0.1%接種量,加入0.2mM IPTG,在16℃條件下誘導(dǎo)16 h表達(dá)效果最好。隨后通過(guò)親和層析、分子篩等純化操作,以其獲得可溶性的目的蛋白,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠樣品。(2)通過(guò)溶劑置換法制備了C60水懸液,并用UV、DLS對(duì)其進(jìn)行了表征。利用Langmiur平衡吸附等溫模型考察了1μg C60可最大結(jié)合5.435μg CaMKⅡα蛋白。DLS結(jié)果顯示納米晶體吸附蛋白后以單體形式為主,僅有少量的團(tuán)聚體。隨后在模擬生理?xiàng)l件下,利用光譜實(shí)驗(yàn)和分子模擬技術(shù)研究了不同溫度下C60與CaMKⅡα相互作用結(jié)合參數(shù)。結(jié)果如下:根據(jù)熒光猝滅原理判斷猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅,并得出在298 K,310 K和318 K三個(gè)不同溫度下的結(jié)合常數(shù)分別為4.87×105,6.47×105,7.65×105 L·mol-1。通過(guò)計(jì)算熱力學(xué)參數(shù),焓變?chǔ)為正值(209.805 kJ/mol),熵變?chǔ)為正值(778.364 J/mol/K)。由此推斷C60與CaMKⅡα結(jié)合是靠疏水作用進(jìn)行的自發(fā)反應(yīng),與分子模擬結(jié)果一致。分子模擬研究進(jìn)一步表明,C60主要以π-π鍵形式和蛋白分子中芳香族或帶電殘基結(jié)合,是對(duì)熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)很好的補(bǔ)充。紫外光譜和同步熒光光譜結(jié)果說(shuō)明C60可以引起蛋白疏水腔中Trp殘基周圍微環(huán)境的疏水性降低,極性增加。此外,根據(jù)圓二色譜的擬合數(shù)據(jù),定量計(jì)算了蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu),表明C60對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的影響,僅使α-螺旋降低了1.8%,β-折疊升高了1.1%。
[Abstract]:After the nanomaterials enter into the organism, they will come into contact with thousands of proteins, which will cause many biological effects and even produce toxicity, mainly due to the interaction of nanomaterials with cells, proteins and so on. The structure, activity and stability of nanomaterials are affected by their binding with proteins, and then the structure and function of proteins are changed. Fullerene nanocrystals have a unique three-dimensional conjugate structure and physical and chemical properties, so they have great potential in medical and biological fields. Their applications include DNA photoshear, enzyme inhibition, tumor therapy, drug carriers, etc. Antibacterial and cell protection. It has been shown that fullerene nanocrystalline (C60) has a similar function to the NR2B subunit of N- methyl D- aspartic acid (NMDA) receptor, and it interacts with Ca ~ (2 +) / calmodulin dependent protein kinase 鈪，

本文編號(hào)：1810424