發(fā)布時間：2018-01-09 01:19

  本文關鍵詞：花狀納米金及抗獨特型納米抗體在真菌毒素免疫學檢測中的應用研究　出處：《南昌大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 真菌毒素 花狀納米金 免疫層析檢測法 抗獨特型納米抗體 環(huán)境友好型免疫檢測法

【摘要】：真菌毒素為產毒真菌產生的一類次級代謝產物,廣泛存在于自然界,可經由污染的農產品和食品對人畜的健康產生嚴重危害,嚴重時可導致癌癥甚至喪命,其中尤以黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB!)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin,OTA)毒性較大,因此建立快速、靈敏且特異性的檢測方法顯得尤為重要。在檢測方法中,免疫學檢測方法因具有靈敏度高、特異性強且簡單方便等優(yōu)點是目前常用的真菌毒素檢測方法,但隨著我國農產品及食品進出口貿易的增加,人們對其質量和安全的要求愈來愈高,普通的免疫學檢測方法已經難以滿足人們對真菌毒素高靈敏性和特異性的要求,因此建立高靈敏和高特異性的真菌毒素免疫學檢測方法勢在必行。本論文以建立高靈敏性和特異性的免疫學分析方法為目的,從檢測信號及免疫學識別元件兩個方面對AFB1和OTA進行新型分析方法的研究。首先合成了具有高光學性質及穩(wěn)定性的花狀納米金(Gold nanoflowers,AuNFs),以其作為新型標記探針,建立了AFB1高靈敏的免疫層析檢測技術;同時,從羊駝天然納米抗體文庫中淘選得到OTA抗獨特型納米抗體(anti-idiotypic nanobody,AId-Nb),以其取代傳統(tǒng)的化學合成抗原,建立了高靈敏的環(huán)境友好型OTA分析方法。主要研究內容包括:1以對苯二酚作為還原劑,通過種子介導生長法,合成高質量的AuNSs和AuNFs。通過改變種子、氯金酸及對苯二酚的添加量,對AuNSs和AuNFs的合成條件進行初步探索,并通過透射電子顯微鏡、紫外-可見光-近紅外分光光度儀和Zeta電位等表征手段對納米金的形貌、光學性質及穩(wěn)定性進行表征。結果顯示,種子的添加量為影響粒徑大小的主要因素,即隨著種子添加量的減少,納米金的粒徑顯著增大,并且表面粗糙程度增加,可逐漸形成AuNFs,當種子的加入體積≤500μL時生成AuNFs;反應速率為影響形貌的主要因素,即降低氯金酸添加量(≤150μL)或增加對苯二酚添加量(3000μL≤V≤4000μL)均可生成AuNFs。75nm AuNFs的吸光度是75nm AuNSs的吸光度的1.5倍,表明相同粒徑的AuNFs不僅具有更強的光學特性,而且穩(wěn)定。2以AuNFs作為新型標記探針,建立AFBi的免疫層析試紙條定量檢測方法。通過抗AFB1單克隆抗體與AuNFs偶聯(lián),以檢測線(T線)吸光值與質控線(C線)吸光值的比值(ODT/ODC)進行定量。對大米樣品進行檢測,并與傳統(tǒng)ELISA方法進行結果對比。結果顯示,當AFBi濃度在0.5～25 pg/mL范圍內,具有較好的線性,且50%抑制濃度(IC50)達到4.17pg/mL(n=5),最低檢測限為0.32pg/mL,較傳統(tǒng)的AuNSs試紙條的靈敏度提高了 10倍。批內及批間變異系數(shù)均小于15%。采用該試紙條和商業(yè)化ELISA試劑盒分別分析50份陰性加標大米樣品,兩者的結果具有較好的線性相關性(R2=0.93)。以AuNFs作為標記探針建立免疫層析檢測方法,具有較好的靈敏度,且具有較廣闊的商業(yè)化應用前景。3以抗OTA單克隆抗體為靶分子,采用“1輪酸洗脫+3輪競爭洗脫”的策略,從羊駝天然納米抗體噬菌體文庫中親和淘選與之結合的AId-Nb噬菌體,并建立實時熒光定量免疫PCR(Q-IPCR)。經淘選得到一株OTA-AId-Nb噬菌體克隆,并基于該噬菌體建立了 ELISA標準曲線,IC50為300pg/mL,靈敏度較基于傳統(tǒng)化學合成抗原的ELISA提高了 8.83倍。進一步構建Q-IPCR,其最低檢測限為4.17 pg/mL,比以噬菌體構建的ELISA方法靈敏度提高了 9倍。實際谷物中的Q-IPCR檢測結果與商業(yè)化ELISA試劑盒檢測結果具有較好的相關性�；贏Id-Nb的環(huán)境友好型的Q-IPCR檢測方法為小分子有毒有害污染物的檢測提供了新的方法。4以OTA-AId-Nb噬菌體特異性基因構建重組表達載體并將其轉入E.coli Rosetta(DE3)中表達。以OTA-AId-Nb取代化學合成抗原,建立了環(huán)境友好型ELISA及免疫層析試紙條法。將OTA-AId-Nb作為包被抗原建立ELISA,線性范圍為0.08-1.0 ng/mL,IC50為0.25 ng/mL,靈敏度較以化學合成抗原建立的ELISA提高了 10倍。與其它四種真菌毒素(DON、AFBi、FB1、ZEN)無交叉反應。以此OTA-AId-Nb取代傳統(tǒng)化學合成抗原,以AuNFs作為標記探針,建立免疫層析檢測方法,其cut off值為4 ng/mL,可實現(xiàn)環(huán)境友好型現(xiàn)場快速檢測。
[Abstract]:A class of secondary metabolites for toxigenic fungi produce mycotoxins, widely exists in the nature, cause serious harm through pollution of agricultural products and food for human and animal health, serious when can cause cancer or even killed, especially in aflatoxin B1 (Aflatoxin B1, AFB!) and ochratoxin A (Ochratoxin OTA), toxicity, so establishing a rapid, sensitive and specific detection method is particularly important. In the detection method, immunological detection methods with high sensitivity, specificity and simple and convenient is a mycotoxin detection method used commonly, but with the increase of China's agricultural products and food import and export trade. The quality and safety of the increasingly high demand, the general immunological detection methods have been difficult to meet the demand of mycotoxins in high sensitivity and specificity, so the establishment of high sensitivity and high specificity It is imperative to mycotoxin immunological detection methods of this paper. For the purpose of establishing immunological analysis method with high sensitivity and specificity, from the two aspects of signal detection and immunological recognition element model analysis method of AFB1 and OTA. The first synthesis of flower like nano gold high optical properties and stability of the Gold (nanoflowers AuNFs), as the new probe labeled an immune chromatography AFB1 high sensitive detection technology; at the same time, from the alpaca natural nano antibody library binding in OTA anti idiotypic antibody (anti-idiotypic nanobody, AId-Nb nano), to replace the traditional chemical synthesis of antigen, the establishment of environmental friendly high sensitive OTA analysis methods. The main research contents include: 1 using hydroquinone as a reducing agent, through seed mediated growth method, synthesis of high quality AuNSs and AuNFs. through the change of seed, gold chloride Adding acid and hydroquinone, explores the synthesis conditions of AuNSs and AuNFs, and by transmission electron microscopy, morphology of gold nanoparticles of ultraviolet visible near infrared spectrophotometer and Zeta potential characterization, optical properties and stability were investigated. The results showed that the adding amount of seeds as the main factors affecting the particle size is decreased with seed addition amount, nano gold particle size increased significantly, and the increase in surface roughness, can be gradually formed when adding AuNFs, seed volume less than or equal to 500 mu L generated AuNFs; the reaction rate for the main factors affecting the morphology, namely reducing chloroauric acid added amount (less than or equal to 150 mu L) or increase the amount of hydroquinone (3000 L = V = 4000 L) can generate AuNFs.75nm AuNFs absorbance is 1.5 times the absorbance of 75Nm AuNSs, showed that the optical properties of the same size AuNFs not only has stronger, and Stable.2 to AuNFs as a new probe labeled immunochromatographic quantitative detection method of the AFBi is established. Through the coupling of anti AFB1 monoclonal antibody and AuNFs to detect line (T line) absorption value and control line (C line) absorption ratio of light value (ODT/ODC) was used for quantitative analysis. To detect the rice samples, and the results were compared with the traditional ELISA method. The results showed that when the concentration of AFBi in 0.5 ~ 25 pg/mL range, good linearity, and the 50% inhibitory concentration (IC50) to 4.17pg/mL (n=5), the lowest detection limit was 0.32pg/mL, compared with the traditional AuNSs test strip sensitivity was 10 times higher than in batch and. Interassay coefficient of variation was less than 15%. by using the test strip and commercial ELISA kit respectively analyzed 50 negative samples spiked rice samples, the result is a good linear correlation (R2=0.93). Using AuNFs as the labeled probe to establish immune chromatography detection method, has better The sensitivity, and has a broad application prospect in commercialization of.3 anti OTA monoclonal antibody as a target molecule, the 1 round +3 round of competition acid elution elution "strategy, from the alpaca natural nano antibody phage library affinity with AId-Nb phage panning, and establish a real-time fluorescence quantitative immuno PCR (Q-IPCR). Strains of OTA-AId-Nb phage clones obtained by phage panning, and based on the established standard curve of ELISA, IC50 for 300pg/mL, the sensitivity is based on the traditional chemical synthesis of antigen ELISA increased 8.83 times. Further construction of Q-IPCR, the lowest detection limit was 4.17 pg/mL, than the ELISA method to construct the phage sensitivity was 9 times higher than Q-IPCR detection. The actual results in grain and commercial ELISA kit test results have good correlation. Environment friendly AId-Nb Q-IPCR detection method based on small molecules for toxic pollutants The test provides a new method of.4 expression vector and transformed into E.coli Rosetta OTA-AId-Nb to construct the recombinant phage specific gene (DE3) expression. To replace the chemical synthesis of antigen to OTA-AId-Nb, the establishment of environmental friendly ELISA and immunochromatographic method. OTA-AId-Nb was used as coating antigen to establish ELISA, linear range is 0.08-1.0 ng/mL, IC50 0.25 ng/mL, the sensitivity is based on the chemical synthesis of the antigen ELISA increased 10 times. And the other four kinds of mycotoxins (DON, AFBi, FB1, ZEN). No cross reaction to OTA-AId-Nb to replace the traditional chemical synthetic antigen, using AuNFs as a probe labeled immunochromatographic method was developed by the cut, off value 4 ng/mL, which can realize rapid detection of environment friendly site.

【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS207.5;TB383.1

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