發(fā)布時間：2017-11-19 07:10

  本文關(guān)鍵詞：利用透射電子顯微鏡對環(huán)狀分子動態(tài)自組裝結(jié)構(gòu)的研究

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【摘要】：正如我們所知,如今所獲取的數(shù)據(jù)能夠快速解決問題比以往任何時候都要重要。透射電子顯微鏡作為納米材料結(jié)構(gòu)表征的主要手段之一,可用于更加快速直接的確定納米材料的結(jié)構(gòu)信息和空間分布等。在獲得清晰準確的實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上來探索納米微觀結(jié)構(gòu)的組裝情況和其隨環(huán)境產(chǎn)生的響應性變化。一個成功的透射電子顯微鏡的圖像與樣品的制備是分不開的。因此我們更需要注意樣品的制備環(huán)節(jié)。根據(jù)文獻資料我們可以了解到,在樣品的制備過程中存在多種不同的制樣方法,這些不同的制樣方法對形貌的影響也各有差異,有時應用不同的制樣方法所獲得結(jié)果截然不同。這使得我們有時很難判斷真實的形貌。因此本實驗過程中也對不同樣品不同制樣方法進行了研究與分析,在經(jīng)歷數(shù)次嘗試后找到合適的制樣方案,從而得出清晰準確的實驗結(jié)果。本文包括三章,在各自結(jié)果與討論部分主要來說明利用透射電子顯微鏡所解決的科學問題,前兩章的內(nèi)容是已發(fā)表的工作,分別發(fā)表在Nature Commun.2015和Angew.Chem.Int.Ed.2016,第三章的工作是目前正在研究中的工作,其共同特點是基于由芳香環(huán)狀分子構(gòu)成的兩親分子的組裝,雖然其分子結(jié)構(gòu)相似但卻擁有不同的組裝行為。首先,在本文的第一章中,著重描述了制樣方法中表面作用的影響,由于本實驗中所研究的兩親性分子所組裝的結(jié)構(gòu)自身的性質(zhì),其納米結(jié)構(gòu)的外層多為親水部分,因此制樣所用的載網(wǎng)表面是否親水將會對于實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。在樣品溶劑揮發(fā)的過程中,通過表面作用,若表面較為疏水則會使得所形成的納米結(jié)構(gòu)在溶劑揮發(fā)過程在銅網(wǎng)表面過于聚集,導致不能得到其真實的組裝形貌,往往會產(chǎn)生一些假象來影響對真實形貌的判斷。這些假象是由于在溶劑揮發(fā)過程中納米結(jié)構(gòu)與銅網(wǎng)表面相互作用逐漸形成的。并不能夠正確的反映組裝的真實狀態(tài)。所以想要得到一個準確的結(jié)果我們首先要知道表面作用有著怎樣的影響。通過查閱已報道的文獻與資料,可以了解到通常由電沉積方法(如銅、鎳、金)得到的銅網(wǎng)其表面已達到高度親水性的狀態(tài),而不需要任何特殊的處理。然而,根據(jù)我所研究的實驗體系的需要,有時需要使其銅網(wǎng)表面變得更加親水,這樣可使得納米結(jié)構(gòu)完整的保留在銅網(wǎng)表面。已報道的常見的方法有以下幾種,可以用于增加透射電子顯微鏡銅網(wǎng)表面的親水性。這些不同的方法和手段也已經(jīng)得到來自世界各地不同的實驗機構(gòu)中不同的研究人員的認可和使用,最初是由羅伯特教授于1997年11月21日提出:1.將銅網(wǎng)表面快速的通過一個酒精燈或一個打火機的火焰中。為了不改變網(wǎng)格本身,或是將精細的柵欄熔化,必須進行快速的通過火焰。2.在丙酮中漂洗,用以除去銅網(wǎng)表面吸附的碳氫化合物。3.用100%的乙醇沖洗銅網(wǎng)表面后再用100%的丙酮進行沖洗銅網(wǎng)表面。4.銅網(wǎng)也可以通過在4%的硝酸中浸漬(5至10次),然后在水中浸漬幾次。建議使用具有PTFE(聚四氟乙烯)涂層的鑷子操作,以避免普通金屬鑷子被酸腐蝕溶解。5.用鑷子(推薦使用PTFE(聚四氟乙烯)涂層)夾取銅網(wǎng)放置于一瓶濃硝酸瓶口處約一秒鐘左右。酸霧會使網(wǎng)格更加親水而不會腐蝕銅網(wǎng)。6.等離子體刻蝕機清潔幾分鐘去除表面所帶有的有機物造成的親水特性的損失。7.在清潔液中浸泡約30秒后用蒸餾水沖洗銅網(wǎng),然后放置一張濾紙在一個干燥的布氏漏斗中,將銅網(wǎng)正面朝上放在濾紙上。這個銅網(wǎng)可以在短時間內(nèi)保持親水性,若長時間后使用需要再重新進行處理。8.將銅網(wǎng)在0.1N鹽酸中浸漬,不需要進一步?jīng)_洗銅網(wǎng)可直接使用。當然這些方法中有些方法對銅網(wǎng)親水性的改善非常顯著,例如用火燒,但是其操作的可控性低,無論是燒的時間程度都很難控制,且表面親水區(qū)域多為不均勻的。再例如用酸進行處理有時效果很好,但對于一些對酸敏感的納米結(jié)構(gòu)來說這種表面處理手段會對形貌本身產(chǎn)生一定的影響。而其余方法中對表面親水性改善的效果并不是非常明顯。因此有很多種方法供我們選擇,根據(jù)自身體系的需求靈活地利用不同的方法來獲取可信的實驗結(jié)果是非常重要的。盡管通過進行實驗可以找到合適的制樣方法,但是干態(tài)透射電子顯微鏡對于反映組裝真實狀態(tài)上始終有一定的限制。例如一些參數(shù)難以控制,染色劑的選擇,染色方法,兩種溶液之間的滲透變化,納米結(jié)構(gòu)干燥后在銅網(wǎng)表面堆積聚集都會導致尺寸和形狀的變化。考慮到這種情況我們還可以利用冷凍透射電子電子顯微鏡這一個重要的研究儀器。冷凍電鏡這項技術(shù)是基于對其溶液中的組裝狀態(tài)進行直接觀察。冷凍透射電子顯微鏡是將溶液狀態(tài)進行直接研究的一種途徑,將溶液制成薄的冰膜,從而觀察其形貌,這種情況下可以直觀的真實的展現(xiàn)分子的自組裝狀態(tài),有時還可以捕捉到組裝的中間狀態(tài),這些數(shù)據(jù)也為解釋組裝原理提供了更多的直接證據(jù)。冷凍固定對于生物材料來說是最佳的保鮮技術(shù)。也可被用于觀察尺寸非常小的細顆粒樣品。對于脫水后會發(fā)生變化的樣品來說,冷凍透射電子顯微鏡是必不可少的。透過冷凍電鏡所觀察到的結(jié)果更接近于溶液中分子組裝的真實狀態(tài)。當然這種技術(shù)中薄膜上的表面張力對分子的分布也會產(chǎn)生一定的影響。冷凍中制備非常薄的冰膜是很困難的,因此對薄膜的制備需要大量的實踐。在不使用染色劑的情況下也無需考慮染色劑與樣品相互對其形貌的影響。當然為提高對比度或無法觀察到納米結(jié)構(gòu)時也可以在冷凍電鏡中使用染色技術(shù),這時通常利用鉬酸銨作為染色劑。這種技術(shù)被稱為“負染色冷凍”(由Adrian等人于1998提出)。然而一旦涉及到使用染色劑我們便需要考慮到染色劑對組裝的結(jié)構(gòu)本身所造成的影響。由于我們所研究的體系,這種兩親性分子所組裝的結(jié)構(gòu)較小,且其電子密度不高,因此在冷凍透射電子顯微鏡中所產(chǎn)生的對比度較低。且由于我們所使用的使分子親水的烷氧鏈,其電子密度與周圍溶劑的電子密度相似,所以在反映整個結(jié)構(gòu)的尺寸上會有一些誤差。此外,由于冷凍透射電子顯微鏡中若冰膜的狀態(tài)不佳也會造成一定的誤導,例如冰的晶體等一些人為因素的影響。如何正確的判斷和分析從冷凍透射電子顯微鏡中得到的結(jié)果需要對一些相關(guān)文獻的查閱與自身的經(jīng)驗積累和干態(tài)透射電子顯微鏡的結(jié)果。相比之下,干態(tài)透射電子顯微鏡所獲得的結(jié)果,其對比度更高,圖像更加清晰,但需要考慮到很多影響因素。冷凍電鏡的結(jié)果雖然能夠更真實反映溶液中分子的組裝狀態(tài),但圖像對比度較低,因此這兩種儀器在形貌研究上各有利弊,但經(jīng)過分析其最終所得到結(jié)果應該是相輔相成互相對應的,在結(jié)合冷凍電子透射顯微鏡和干態(tài)透射電子顯微鏡兩項實驗的結(jié)果后我們才能夠得到相互對應的準確的結(jié)果。通過利用透射電子顯微鏡對芳香環(huán)狀兩親分子1的組裝形貌的研究,首先我們可以確認利用所設計的環(huán)狀兩親分子可以構(gòu)筑尺寸均勻的約幾毫米長的管狀結(jié)構(gòu),每根納米管的外徑約為9納米和內(nèi)徑約為2納米。將管的溶液稀釋后,我們發(fā)現(xiàn)碳納米管離散成為纖維,每根纖維的直徑約為4納米。通過加熱具有納米管的溶液后,發(fā)現(xiàn)這種納米管將完全收縮閉合成為纖維狀態(tài),這種纖維的直徑約為6納米。將加熱的溶液冷卻后纖維將重新恢復到管狀結(jié)構(gòu),經(jīng)過多次加熱和冷卻循環(huán)證實這種打開和關(guān)閉的行為是可逆的,因此證明我們成功地利用這種圓盤形芳香環(huán)狀分子構(gòu)筑了高度動態(tài)的管狀納米結(jié)構(gòu),可以快速隨溫度變化在打開和關(guān)閉兩種狀態(tài)進行切換。其次,在第二章中通過一些實驗數(shù)據(jù)描述染色方法的影響。染色包括正染法和負染法。正染法可以用來增強樣本的對比度。它是基于一個重金屬鹽(鈾或鉛)和樣品分子之間的化學反應。這種技術(shù)適用于輕元素組成的,細顆粒物質(zhì)或塊狀樣品以及冷凍超薄切片等。它特別適用于聚合物和生物材料。本文中所著重描述的染色方法主要為負染色,負染法是一種簡便、快速、定性的,檢測細胞器結(jié)構(gòu)、個體大分子和病毒的常用方法。然而,該方法不適于在高分辨條件下對樣品進行檢測,這是種在技術(shù)上要求較高的方法,在這種情況下應對樣品進行快速冷凍或使樣品玻璃化。此外,由于負染色涉及到沉積的重原子污漬,人為因素對結(jié)構(gòu)的影響,往往會出現(xiàn)如扁平化的球形或圓柱形等結(jié)構(gòu)。但是,負染法仍然是一種非常有用的技術(shù),操作簡單快捷,并且染色時不需要專門的設備。常用的負染色劑包括磷鎢酸鈉(鉀)、中性磷鎢酸、醋酸雙氧鈾、硅鎢酸鈉、鉬酸銨以及甲胺鎢酸鹽,其他不常見的負染色劑包括:金硫葡萄糖,醋酸鑭鎢酸鋰、鈉磷酸鋯、硼鎢酸鹽、甲酸鋁、鈾酰甲酸、草酸和硫酸鈾酰。本文中所使用到的染色劑包括:(1)醋酸雙氧鈾:將醋酸雙氧鈾溶解在蒸餾水中,制成質(zhì)量分數(shù)為0.2%到2%的水溶液,p H值約為4.2-4.5�？捎糜诙喾N類型的樣品負染色。將醋酸雙氧鈾的水溶液利用0.22微米的濾頭(已預先大量雙蒸餾水沖洗過濾過濾)。過濾后的染色劑應存放在4℃的環(huán)境中避光保存。醋酸雙氧鈾溶液也可應用于病毒。醋酸雙氧鈾和鈾鹽的優(yōu)點是它們產(chǎn)生非常高的電子密度和圖像對比度以及對圖像紋理精細。特別適于小顆粒樣品制備更易得到紋理精細的圖像。但是在酸性條件下不穩(wěn)定的樣品,不建議使用低p H值的染色劑。此外,在使用它時應當注意它會在為中性或在許多鹽的存在下沉淀析出。醋酸雙氧鈾及其衍生物是由Van Bruggen等人在1960年提出的。(2)磷鎢酸鈉(鉀):一種最常用的負染色劑,雖然會對許多膜系統(tǒng)有明顯的破壞作用。不作為固定劑,可以破壞病毒�？膳c脂蛋白相互作用,并形成的“髓鞘”。但是,它可以用于中性p H值,并且是不會與鹽和生物介質(zhì)發(fā)生沉淀析出現(xiàn)象。磷鎢酸鉀是由Hall在1955年提出的。(3)中性磷鎢酸:中性PTA 3%溶液(用氫氧化鈉調(diào)節(jié)p H值為7)是一個適用于測試病毒的有效染色劑,適于在低p H值時使用,但其所產(chǎn)生的對比度較醋酸雙氧鈾低。(4)鉬酸銨:在蒸餾水中配制1至2%的鉬酸銨溶液,用銨或氫氧化鈉將溶液的p H調(diào)節(jié)至7。p H值不要調(diào)節(jié)超過7,否則會導致其結(jié)晶。鉬酸銨2%溶液對滲透敏感的細胞器染色是特別有用的。雖然這種負染色劑適用于對多種類型的樣品進行染色,但是其所產(chǎn)生的對比度較其他染色劑低。這種染色劑也被用于負染色冷凍透射電子顯微鏡,冷凍超薄切片。它是由Munn在1968年提出的。選擇合適的染色劑固然重要,對于染色方法的選擇以及染色時間長短的控制也非常必要。文獻當中描述了很多種方法來進行樣品制備。當然由于研究體系的不同,最重要的還是要適合于自身需求。本文中的前兩個章節(jié)中,多需要測量管狀結(jié)構(gòu),首先需要保證管狀結(jié)構(gòu)的完整性,其次是通過合適的染色方法將管狀結(jié)構(gòu)清晰地展現(xiàn)出來。在干態(tài)透射電子顯微鏡制備方面,如何獲得清楚的管狀結(jié)構(gòu)這需要我們在考慮到多種影響因素。由于本研究體系中納米結(jié)構(gòu)對外界環(huán)境的變化非常敏感,所以在制樣方案的選擇上所做的工作將會對獲得準確形貌有著深遠意義,只有在獲得真實的,可信的,合理的形貌的基礎(chǔ)上才可以對其組裝原理方面進行一系列的探索與研究。通過分析從透射電子顯微鏡所獲得的芳香環(huán)狀兩親分子2的組裝形貌結(jié)果,這種圓盤形芳香環(huán)狀分子首先沿垂直方向自組裝生成柱狀纖維結(jié)構(gòu),然后由8根柱狀纖維沿橫向緊密排列形成平面的條帶結(jié)構(gòu)。所形成的條帶寬度約為28納米,厚度約為3.5納米。值得一提的是,這種平面的條帶隨著果糖的加入逐漸卷曲最終形成外徑為8納米的管狀結(jié)構(gòu)。最后,在第三章中,在透射銅網(wǎng)表面的處理過程中我使用了輝光處理儀,這是一臺通過輝光放電使得銅網(wǎng)表面帶電荷的儀器。通過對其放電時的環(huán)境中剩余氣體的種類的控制,來控制其使銅網(wǎng)表面帶有正電或者負電,從而控制銅網(wǎng)的表面呈現(xiàn)親水或者疏水的性質(zhì)。其操作簡單快捷,且可控性很強,處理過的銅網(wǎng)表面非常均勻呈現(xiàn)親/疏水性。當然對于一些自身攜帶電荷的樣品這種處理手段也會對其形貌產(chǎn)生一定的影響。根據(jù)透射電子顯微鏡所得到的形貌分析,這種環(huán)狀分子在高濃度條件下形成外徑約為12納米內(nèi)徑約為2納米的環(huán)狀結(jié)構(gòu),隨著其水溶液濃度的減低,逐漸由環(huán)狀結(jié)構(gòu)變?yōu)橹睆郊s為9納米的螺旋纖維狀結(jié)構(gòu)。在形成螺旋纖維狀結(jié)構(gòu)的濃度條件下,隨著暈苯的加入,螺旋纖維被切斷回到環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在形成環(huán)狀分子的條件下加入客體分子六螺烯后,其組裝結(jié)構(gòu)可變?yōu)橹睆郊s12納米的螺旋彈簧狀結(jié)構(gòu)。并且隨時間的延長,這種螺旋彈簧狀結(jié)構(gòu)的長度呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢。目前這項工作還處于研究當中,還需要進行一系列更為系統(tǒng)的研究來證實我們對其組裝原理的猜想是否正確。在獲得清晰準確的形貌結(jié)果的基礎(chǔ)上來探索納米微觀結(jié)構(gòu)的組裝情況和其隨環(huán)境產(chǎn)生的響應性變化。文中的納米結(jié)構(gòu)是由環(huán)狀芳香兩親分子在溶液中通過親疏水作用以及多價相互作用組裝而形成的,為了進一步了解這種通過自組裝而成的納米材料的組裝過程和組裝原理,透射電子顯微鏡成為至關(guān)重要的研究工具,這使得我們能夠更加直觀地看到組裝的進程和結(jié)果。獲得清晰的結(jié)果固然重要但是結(jié)合所獲得形貌結(jié)果來分析分子的組裝原理更為重要,因此需要結(jié)合其他同事在其他實驗上面的研究,例如結(jié)合所用于組裝的芳香兩親分子的性質(zhì)、穩(wěn)定構(gòu)象、軟件模擬分析、波譜學、光譜學等多方面的研究數(shù)據(jù)信息,從而合理的解釋這些納米結(jié)構(gòu)的組裝原理和響應性行為的發(fā)生原因。在了解這些納米材料的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和其對于環(huán)境變化所產(chǎn)生的響應性行為的基礎(chǔ)上,也便于人們開發(fā)其應用方面的價值。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O641;TB383.1

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