【摘要】 目的：兔骨髓基質(zhì)細胞體外誘導(dǎo)為成骨細胞，構(gòu)建骨髓基質(zhì)成骨細胞和賴氨酸納米生物材料的復(fù)合培養(yǎng)模型。探討以賴氨酸生物活性材料作為骨組織工程支架材料，以及賴氨酸生物活性材料與成骨細胞復(fù)合體體內(nèi)成骨情況。方法：取兔骨髓在體外分離出骨髓基質(zhì)細胞(MSCs)，利用骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長的特點，體外培養(yǎng)骨髓細胞。用加有地塞米松，β—甘油磷酸鈉和VitC的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其成為骨髓基質(zhì)成骨細胞，觀察其形態(tài)學(xué)特點，用堿性磷酸酶(ALP)，Ⅰ型膠原和骨髓基質(zhì)細胞體外成骨能力的檢測等方法鑒定其生物學(xué)特性。以賴氨酸乙酯二鹽酸鹽為原料用納米技術(shù)合成的新型生物材料利用氣體發(fā)泡法并結(jié)合顆粒濾除法制孔。用誘導(dǎo)后的兔骨髓基質(zhì)成骨細胞與其復(fù)合培養(yǎng)，在光鏡(HE染色)和電鏡下觀察成骨細胞在材料上的粘附、生長情況。將復(fù)合培養(yǎng)與原誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSC進行ALP含量比較，然后將復(fù)合培養(yǎng)后的細胞進行再培養(yǎng)，觀察材料對細胞增殖及生物活性的影響。最后將細胞材料復(fù)合物植入原家兔腿部肌肉，組織學(xué)觀察。結(jié)果：骨髓基質(zhì)細胞呈貼壁生長，誘導(dǎo)后可向成骨細胞分化，細胞呈成骨細胞形態(tài)為梭形和多角形，無接觸抑制，可形成鈣化結(jié)節(jié)。用改良鈣鈷染色法檢測得誘導(dǎo)細胞堿性磷酸活性呈強陽性。Ⅰ型膠原染色陽性。骨髓基質(zhì)成骨細胞可以在賴氨酸納米生物活性材料上繼續(xù)粘附、生長、增殖和分化。掃描電鏡檢測可見多空材料孔隙率可達90％，孔徑在100-300μm，孔隙內(nèi)也可見成團的細胞長入，多呈梭型，被細胞外基質(zhì)包圍。復(fù)合培養(yǎng)BMSC與原誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSC的ALP含量比較，沒有差別(p＞0.05)。再培養(yǎng)細胞增殖能力沒變化(p＞0.05)。組織學(xué)見4w時見出現(xiàn)大量致密的不規(guī)則類骨質(zhì)，在其周邊可見成骨細胞聚集增多，部分區(qū)域出現(xiàn)骨陷窩結(jié)構(gòu)，8w時出現(xiàn)大量較典型的骨小梁結(jié)構(gòu)。結(jié)論：用骨髓基質(zhì)在體外誘導(dǎo)成為成骨細胞可以作為骨組織工程選擇種子細胞的方法。以賴氨酸二異氰酸酯為原料制成的納米骨材料可以作為骨組織工程的支架材料，成骨細胞接種于新型骨組織工程材料上在體外培養(yǎng)，可以生長、增殖和分泌細胞外基質(zhì)，材料與細胞間有很好的生物相容性。材料與細胞的復(fù)合物體內(nèi)可以成骨，骨髓基質(zhì)成骨細胞與賴氨酸納米生物活性材料構(gòu)建新型組織工程骨是可行的。 

實驗流程圖

 

材料與方法

 

1、實驗材料
1.1動物
家兔，四月齡，體重2kg左右，4只，雄性，由中南大學(xué)實驗動物部提供
1.2藥品
肝素(loou/ml)                        湘雅醫(yī)院藥劑科
高糖DMEM培養(yǎng)基                       長沙麗欣生物技術(shù)有限公司
PBS平衡鹽溶液                        試驗室自制
Percoll淋巴分離液                    上海華精生物高科技有限公司
B一甘油磷酸鈉                        Sigma公司產(chǎn)品
胰蛋白酶(0.25%)                      長沙麗欣生物技術(shù)有限公司
鼠抗兔I型膠原抗體                    北京中山公司
15%小牛血清                          中南大學(xué)細胞中心
Dex(10一smox/l)                      湘雅醫(yī)院藥劑科
戊巴比妥鈉                           湘雅醫(yī)院藥劑科
Vitc(5oug/ml)                        湘雅醫(yī)院藥劑科
青霉素(loou/ml)                      湘雅醫(yī)院藥劑科
鏈霉素(100ug/ml)                     湘雅醫(yī)院藥劑科
地塞米松(10-8mol/I)                  湘雅醫(yī)院藥劑科

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2、實驗方法

2.1BMSC的分離、增殖及誘導(dǎo)培養(yǎng)
培養(yǎng)瓶中加sml完全培養(yǎng)基，置入37℃，5%COZ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，以后隔天換液一次。當細胞長滿培養(yǎng)瓶底80%時吸除培養(yǎng)基，筆耕文化推薦期刊，加入適量0.25%胰蛋白酶消化細胞，當觀察到細胞突起回縮、形態(tài)變圓、細胞間隙增大時，加入含巧%小牛血清的DMEM液Zml中止消化，吹打使細胞脫壁并分散為單個細胞，收集消化所得的細胞懸液至離心管中，以1000印m離心1omin，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基制成細胞懸液并混合均勻，以1:2的比例傳代培養(yǎng)即1個25ml培養(yǎng)瓶中的細胞消化后接種在2個25nil培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。取生長良好的二代細胞分為兩組:實驗組加入條件培養(yǎng)基(DMEM+15%FCS+10~o扒p一甘油磷酸鈉+0.1pmol幾地塞米松+som幼Vite)，37oC，5%COZ，飽和濕度靜置培養(yǎng)，每2天半量換液一次，連續(xù)培養(yǎng)1一2周。對照組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。
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結(jié)果···········11
1、相差顯微鏡觀察··········11
2·復(fù)合后光鏡觀察··········15
3、掃描電鏡觀察··············16
4、復(fù)合培養(yǎng)后堿性磷酸酶(ALP)含量比較········18
5、再培養(yǎng)成骨細胞的觀察············19
6、復(fù)合體植入家兔腿部肌肉的組織學(xué)觀察·······20

討論·············23

 

討論

 

骨組織工程要求在體外提供有利于成骨細胞成骨的正常的細胞生存環(huán)境，即適合細胞種植的基質(zhì)材料(支架材料)。在骨組織工程中理想的支架材料要求滿足以下條件:①良好的生物相容性:除滿足生物材料的一般要求，如無毒、不致畸之外，還要有利于種子細胞的粘附、增殖，降解產(chǎn)物對細胞無毒害作用，不引起炎癥反應(yīng)，有利于細胞的生長和分化。②良好的生物降解性:支架材料在完成支撐功能后應(yīng)能降解，降解速率應(yīng)與骨組織細胞生長速率相適應(yīng)。③具有三維立體多孔結(jié)構(gòu):支架材料可加工成三維立體結(jié)構(gòu)，孔隙率高，最好達90%以上，具有高的比表面積。這種結(jié)構(gòu)可提供寬大空間，利于細胞粘附生長、細胞外基質(zhì)沉淀、營養(yǎng)和氧氣進入、代謝產(chǎn)物的排出，也有利于血管和神經(jīng)長入。④可塑性和一定的機械強度:支架材料具有良好的可塑性，可預(yù)先制作成一定形狀，并具有一定的機械強度，為新生組織提供支撐，并保持一定時間直至新生組織具有適當力學(xué)特性。⑤良好的材料一細胞界面:材料應(yīng)提供良好的材料細胞作用界面，利于細胞粘附、生長，更重要的是能激活細胞特異基因表達，維持正常細胞的表型表達。目前還沒有一種支架材料可以全部滿足以上要求。因此，我們將“綠色化學(xué)”的原理應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，即用于納米生物醫(yī)學(xué)材料合成的全部原料均為無毒并可被人體吸收的物質(zhì)，包括反應(yīng)溶劑。利用納米技術(shù)以賴氨酸乙酷二鹽酸鹽為基質(zhì)通過有機合成、聚合反應(yīng)采用超臨界二氧化碳聚合及超生波分散技術(shù)合成了這種納米高分子材料。這種納米高分子材料有望符合骨組織工程對支架材料的要求。

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結(jié)論

 

骨缺損的治療一直是臨床上有待解決的難題之一，組織工程的發(fā)展為這一問題的解決帶來了新的希望，本試驗就是依據(jù)組織工程的原理，以及細胞培養(yǎng)體外實驗來證明新型的骨組織工程材料�；诒緦嶒灥慕Y(jié)果，我們得出以下結(jié)論:
1.成骨細胞接種于新型骨組織工程材料上在體外培養(yǎng)，可以生長、增殖和分泌細胞外基質(zhì)。
2.由骨髓基質(zhì)成骨細胞和這種賴氨酸納米生物活性材料的復(fù)合體在動物體內(nèi)能形成骨組織。

3.本實驗證明了，以賴氨酸乙酷二鹽酸鹽為原料制成的納米骨材料可以作為骨組織工程的支架材料及以這種材料構(gòu)建新型的組織工程骨的可行性。

 
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本文編號：10969