本研究旨在研制一種以緊密素為檢測(cè)靶標(biāo)的間接ELISA技術(shù),檢測(cè)血清中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxigenic Escherichia coli,STEC)的抗體水平。根據(jù)緊密素27個(gè)亞型的N端保守序列,體外表達(dá)390⁵43 aa片段制備包被抗原,通過(guò)敏感性、特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),建立檢測(cè)STEC的抗體的間接EIISA方法。經(jīng)優(yōu)化篩選的間接ELISA最佳反應(yīng)條件:抗原包被濃度3 ng/孔,待檢血清稀釋比例1∶200,HRP-兔抗羊Ig G、HRP-兔抗牛Ig G的工作濃度均為1∶15000,5%脫脂奶封閉l h,底物作用時(shí)間10min,用于牛、羊疫苗抗體檢測(cè)或者STEC大腸桿菌感染的監(jiān)測(cè)。

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要試劑
    1.2 引物設(shè)計(jì)及合成
    1.3 重組蛋白表達(dá)、純化和Western blotting檢測(cè)
    1.4 間接ELISA方法的建立
        1.4.1 重組蛋白抗原最適包被濃度及待檢血清稀釋濃度的確定
        1.4.2 重組抗原包被條件的確定
        1.4.3 封閉液以及封閉時(shí)間的確定
        1.4.4 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)和作用時(shí)間的確定
        1.4.5 血清最佳作用時(shí)間的確定
        1.4.6 底物反應(yīng)時(shí)間的確定
        1.4.7 不同種屬酶標(biāo)Ig G的比較
        1.4.8 特異性交叉試驗(yàn)
        1.4.9 陰陽(yáng)性臨界值
    1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
        1.5.1 批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)
        1.5.2 批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)
    1.6 ELISA方法檢測(cè)免疫動(dòng)物的抗體滴度
        1.6.1 免疫�？贵w檢測(cè)
        1.6.2 山羊抗體檢測(cè)
2 結(jié)果與分析
    2.1 重組蛋白表達(dá)和Western blotting鑒定
    2.2 間接ELISA方法的建立
        2.2.1 最適抗原包被濃度和血清稀釋度的確定
        2.2.2 抗原包被條件、封閉條件和酶標(biāo)Ig G的工作條件優(yōu)化
        2.2.3 顯色時(shí)間優(yōu)化
        2.2.4 不同種屬酶標(biāo)二抗的比較
        2.2.5 陰陽(yáng)性臨界值確定
        2.2.6 特異性交叉試驗(yàn)
    2.3 重復(fù)性檢測(cè)
    2.4 ELISA試劑盒檢測(cè)免疫動(dòng)物的抗體
        2.4.1 免疫�？贵w檢測(cè)
        2.4.2 山羊抗體檢測(cè)
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本文編號(hào)：3801593