標(biāo)記免疫分析技術(shù)問世于60年代初期,由此開創(chuàng)了標(biāo)記免疫分析的新紀(jì)元。標(biāo)記免疫分析是將多種標(biāo)記示蹤技術(shù)的高度靈敏性和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性相結(jié)合的產(chǎn)物。經(jīng)過近幾十年的發(fā)展,標(biāo)記免疫分析技術(shù)促使臨床生化分析由常量分析提高到微量和超微量分析,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、療效觀察和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究。在固相免疫測(cè)定中,待測(cè)分析物與載體固定的抗體形成反應(yīng)復(fù)合物,而捕獲抗原用的抗體通過與另外的捕獲蛋白結(jié)合或者簡(jiǎn)單的疏水作用使其固定于載體表面。利用抗原抗體反應(yīng)具有高特異性和高親和性的特點(diǎn),固相免疫測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)單快速分離未結(jié)合反應(yīng)物的方法,通過檢測(cè)標(biāo)記抗體的信號(hào)就可以測(cè)定出待測(cè)分析物的濃度。隨著檢測(cè)方法的革新和技術(shù)的進(jìn)步,發(fā)展到目前,標(biāo)記免疫分析法已包括放射免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)、熒光免疫分析法(Fluorescence immunoassay, FIA)、酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme linked immunosorbent assay, EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Chemiluminescence immunoassay, CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)等。在這幾種方法中,TRFIA是一種新型的超微量的標(biāo)記免疫分析方法,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、標(biāo)記物穩(wěn)定性好、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性高、不受樣品的自然熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到人們的青睞,成為繼放射免疫分析之后,標(biāo)記免疫分析法發(fā)展的一個(gè)新的里程碑,并以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在近些年迅速發(fā)展,已延伸至醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)和食品安全等各個(gè)領(lǐng)域。時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)通常采用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素銪(Eu)、鋱(Tb)、釤(sm)、和鏑(Dy)及其螯合物作為示蹤物,具有激發(fā)光譜帶寬、發(fā)射光譜帶窄、Stokes位移大、熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)、熒光強(qiáng)度高和標(biāo)記物理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)越性。此外,利用上述鑭系稀土離子的熒光衰減時(shí)間長(zhǎng)及波長(zhǎng)差異大的特點(diǎn),可以利用多種標(biāo)記的鑭系元素離子的熒光進(jìn)行多分析物同時(shí)檢測(cè)。多元免疫分析方法擁有許多傳統(tǒng)免疫分析無(wú)以倫比的優(yōu)勢(shì),可一次性對(duì)具有聯(lián)合檢測(cè)意義的多個(gè)待測(cè)物進(jìn)行篩選,與單一靶點(diǎn)作用的傳統(tǒng)免疫分析篩選方法相比通量更高,具有省時(shí)省力省樣品等優(yōu)點(diǎn),在臨床免疫學(xué)檢測(cè)方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。在臨床醫(yī)學(xué)診斷中,為提高診斷敏感性、特異性,往往需要多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)：癌抗原125(CA125)和人附睪分泌蛋白-4(Human epididymis protein-4, HE4)相結(jié)合預(yù)測(cè)卵巢惡性腫瘤;甲狀腺功能檢測(cè)里面,甲狀腺相關(guān)激素濃度變化跟不同的甲狀腺功能障礙密切相關(guān)；血清C肽和胰島素水平的同時(shí)檢測(cè)對(duì)糖尿病的分型診斷具有很大幫助；血液篩查中需要對(duì)人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、梅毒螺旋體(Treponemiapallidum, TP)等多種傳染病進(jìn)行檢測(cè)及乙肝五項(xiàng)、TORCH的孕前檢查等等。由此可見,對(duì)多元時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的研究具有很強(qiáng)的理論和現(xiàn)實(shí)意義。磁性納米顆粒是納米粒子的一種,是20世紀(jì)50年代研制出的一種新型功能材料。磁性納米顆粒多由鐵、鈷和鎳等過渡金屬的氧化物所構(gòu)成,在外加磁場(chǎng)力的作用下,磁性納米顆粒能夠快速地與底液相分離,具有操作簡(jiǎn)便、分離效率高、特殊的理化性質(zhì)、較大的比表面積及良好的物理穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),是一種性能優(yōu)良的磁性分離載體。目前,將磁性納米顆粒高效的分離和富集作用與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性相結(jié)合,成為了近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)一免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMB),并在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離和培養(yǎng)、生物大分子純化和分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用,同時(shí)已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。目前,免疫磁珠結(jié)合酶免檢測(cè)方法是其在免疫檢測(cè)領(lǐng)域最主要的應(yīng)用,該免疫磁珠-ELISA方法主要用于免疫檢測(cè),細(xì)胞和微生物的分離,蛋白質(zhì)、DNA、RNA以及mRNA等生物大分子純化檢測(cè),并且免疫磁珠結(jié)合熒光免疫分析或化學(xué)發(fā)光免疫分析法應(yīng)用于食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)方面也有不少研究,但免疫磁珠結(jié)合時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)應(yīng)用于臨床疾病標(biāo)志物分子檢測(cè)的研究較少。癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)是一種分子量約為200KD的多糖蛋白復(fù)合物,于1965年首先由加拿大學(xué)者從結(jié)腸腺瘤和胎兒腸中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原。一般情況下,CEA是由胎兒胃腸道上皮組織、胰腺和肝的細(xì)胞所合成,通常在孕婦妊娠前6個(gè)月內(nèi)CEA含量增高,生產(chǎn)后母體血清中含量極低,健康成年人血清中CEA濃度較低,故名為癌胚抗原。CEA屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原,由內(nèi)胚層細(xì)胞分化而來,在細(xì)胞質(zhì)中形成,穿過細(xì)胞膜進(jìn)入體液,故可在多種液體中檢測(cè)出。癌胚抗原是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物,在多種胃腸道惡性腫瘤患者的血清中CEA的含量明顯升高,如直結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌等,其中直結(jié)腸癌陽(yáng)性率最高。此外,在乳腺癌、肺癌及其它惡性腫瘤的血清中也有不同水平的升高。CEA作為一種最常見的腫瘤標(biāo)記物,雖然不能作為特異性指標(biāo)診斷某種惡性腫瘤,但是在用于各種惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤分期、監(jiān)視病情和治療以及預(yù)后判斷等方面,具有重要的臨床價(jià)值。唐氏綜合征又稱21-三體綜合征或先天愚型,是發(fā)病率較高的染色體病。其主要特征是嚴(yán)重先天智力障礙,特殊面容,并常伴有各種先天畸形。產(chǎn)前篩查是通過采用經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和無(wú)創(chuàng)傷的檢測(cè)方法,從孕婦中篩查出懷有某種先天性缺陷兒(如21-三體綜合征、神經(jīng)管缺陷)的高危孕婦,最大限度的減少異常胎兒的出生,以達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。目前這些病尚無(wú)有效的治療手段,因此產(chǎn)前篩查和診斷21-三體綜合征、神經(jīng)管缺陷以降低其患病兒的出生率顯得尤為重要。近年來許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)孕婦血清中胎兒胎盤產(chǎn)生的甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)、游離絨毛膜促性腺激素(Free β-human chorionic gonadotrophin, Free β-hCG)、妊娠相關(guān)血清蛋白(Pregnancy-associated plasma protein-A, PAPP-A)和游離雌三醇(Unconjugated estriol, uE3)等含量異常與21-三體綜合征、神經(jīng)管缺陷密切相關(guān),并將這些標(biāo)記物應(yīng)用于產(chǎn)前篩查。由于迄今為止發(fā)現(xiàn)的血清標(biāo)志物在單獨(dú)使用時(shí),大都存在檢出率低、假陽(yáng)性、假陰性等缺陷,以期彌補(bǔ)上述缺陷,大多采用多項(xiàng)標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)。Free β-hCG和PAPP-A是孕早期(8到14周)篩查先天缺陷兒的最佳組合,而孕中期(14～24周)采用母體血清AFP和Free β-hCG聯(lián)合檢測(cè),結(jié)合年齡、孕周等因素進(jìn)行唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查,檢出率可達(dá)60%～80%。由于方法的簡(jiǎn)便易行且無(wú)創(chuàng)傷性,便于在孕婦中進(jìn)行大規(guī)模的篩查,最大可能的避免這些缺陷胎兒的出生,提高出生人口的素質(zhì)。盡管在TRFIA技術(shù)領(lǐng)域取得了很大的成功,但是仍然迫切需要不斷地完善和改進(jìn)現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù),建立更為簡(jiǎn)單、特異、靈敏的臨床免疫分析檢測(cè)方法以應(yīng)對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷和生物醫(yī)學(xué)研究的快速發(fā)展和需求。本課題是在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上,旨在結(jié)合磁分離技術(shù)和TRFIA技術(shù),通過將特異性抗體偶聯(lián)在磁珠表面,即免疫磁珠,用免疫磁珠、鑭系稀土元素螯合物標(biāo)記抗體及樣本中待測(cè)抗原在反應(yīng)管中經(jīng)過振蕩孵育后形成免疫磁珠-抗原-鑭系稀土元素螯合物標(biāo)抗體復(fù)合物。加入增強(qiáng)液振蕩反應(yīng)后,在紫外光的激發(fā)下發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光,通過時(shí)間分辨儀器測(cè)定其熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與樣品中的待測(cè)分析物濃度成正比,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中抗原含量。除擁有TRFIA技術(shù)的靈敏度高、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等諸多優(yōu)點(diǎn)外,還通過免疫磁珠的富集作用以及磁珠在液體中充分?jǐn)U散使得結(jié)合表面積擴(kuò)大,大大縮短反應(yīng)時(shí)間,提高檢測(cè)靈敏度。通常情況下,大部分免疫分析技術(shù)通過物理吸附的方法將抗原或者抗體包被在96微孔板上,用于捕獲樣本中的待測(cè)分析物。但由于空間位阻的原因,抗原抗體結(jié)合并不對(duì)稱而且結(jié)合量有限,在檢測(cè)高濃度樣品時(shí)很容易形成HOOK效應(yīng)。然而磁珠與抗體通過化學(xué)基團(tuán)定向連接,能夠使偶聯(lián)的抗原或者抗體暴露出更多的活性結(jié)合位點(diǎn),大大減少配對(duì)抗原或者抗體的用量以及提高檢測(cè)的線性范圍。該技術(shù)易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,并克服了傳統(tǒng)微孔板式TRFIA技術(shù)需要樣本累積到一定數(shù)量才能檢測(cè)的缺點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了樣本的即時(shí)檢測(cè)。此外,以磁珠作為固相載體,可以分別包被針對(duì)不同檢測(cè)項(xiàng)目的抗原或者抗體,再利用多種鑭系稀土元素螯合物分別標(biāo)記配對(duì)的抗原或者抗體,更容易實(shí)現(xiàn)多元分析。本研究主要是利用磁珠作為包被抗體的固相載體并結(jié)合時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù),采用雙抗體夾心法研制出磁珠時(shí)間分辨檢測(cè)CEA的單標(biāo)記熒光免疫分析試劑和同時(shí)檢測(cè)AFP及Free β-hCG的雙標(biāo)記熒光免疫分析試劑。本課題實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要分為三大部分：1)、用不同粒徑、不同化學(xué)基團(tuán)修飾的磁珠連接抗體,選取合適的磁珠作為固相載體并且優(yōu)化連接工藝和鑭系稀土元素螯合物標(biāo)記抗體；2)、反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化,并通過優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)試劑盒的各項(xiàng)性能指標(biāo)作出全面而整體的分析,包括：準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密度、抗干擾性分析、穩(wěn)定性：3)、用自制試劑盒與國(guó)外同類的診斷試劑進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)其初步應(yīng)用于臨床檢測(cè)的可行性。研究結(jié)果一顯示,自制的CEA磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑在最優(yōu)條件下,經(jīng)測(cè)定本試劑分析靈敏度為0.5 ng/mL,將抗原稀釋成不同濃度進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1～1000 ng/mL。用本研發(fā)試劑對(duì)三個(gè)不同濃度自制的CEA質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果本試劑的分析內(nèi)變異系數(shù)(CV%)為2.722%～3.252%和分析間變異系數(shù)(CV%)為3.157%-3.765%�；厥章蕦�(shí)驗(yàn)結(jié)果為90.1%-99.2%,符合試劑盒要求。將高濃度的A FP、CA125、癌抗原19-9(CA19-9)及人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)當(dāng)作樣品用本試劑測(cè)定,結(jié)果表明無(wú)明顯交叉反應(yīng)。檢測(cè)質(zhì)控樣本時(shí)不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅索的干擾。試劑盒放置于37℃7天或4℃ 1年,各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求,穩(wěn)定性較好。用自制的試劑分別與PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒和雅培公司的化學(xué)發(fā)光試劑盒同時(shí)對(duì)239份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。以自制試劑測(cè)定血樣的CEA濃度結(jié)果為橫坐標(biāo),以P erkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA測(cè)定的濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析,相關(guān)方程為：Y=1.049X+1.696,相關(guān)系數(shù)R2=0.970,P0.001。以自制試劑測(cè)定血樣的CEA濃度結(jié)果為橫坐標(biāo),以雅培公司化學(xué)發(fā)光測(cè)定的CEA濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析,相關(guān)方程為：Y=0.873X-3.802,相關(guān)系數(shù)R2=0.951,P0.001。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明,本方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA和羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑盒臨床血樣測(cè)值均具有顯著相關(guān)性。研究結(jié)果二顯示,自制的AFP及Free β-hCG雙標(biāo)記磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑在優(yōu)化的條件下,經(jīng)測(cè)定本試劑AFP分析靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍分別為0.05 ng/mL和0.1-750 ng/mL, Free β-HCG分析靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍分別為0.08 ng/mL和0.16～450 ng/mL。用本自制試劑對(duì)AFP及Free β-hCG質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果AFP的分析內(nèi)變異系數(shù)為2.6%～5.1%和分析間變異系數(shù)為1.9%～5.1%,Free-β-HCG的分析內(nèi)變異系數(shù)為4.1%-4.7%和分析間變異系數(shù)為4.7%～5.0%�；厥章蕦�(shí)驗(yàn)96.0%-106.0%,符合試劑盒要求。將高濃度的CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、LH、FSH、TSH及hCG當(dāng)作樣品用本試劑測(cè)定,結(jié)果表明無(wú)明顯交叉反應(yīng)。檢測(cè)質(zhì)控樣本時(shí)不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天或4℃ 1年,各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求,穩(wěn)定性較好。用自制的試劑和PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒同時(shí)對(duì)444份孕中期血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。以自制試劑盒測(cè)定血樣的濃度結(jié)果為橫坐標(biāo),以PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒測(cè)定的濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析,AFP相關(guān)方程為：Y=0.961X+1.554,相關(guān)系數(shù)R2=0.970,P0.001;Free β-hCG相關(guān)方程為：Y=1.044X-1.421,相關(guān)系數(shù)R2=0.966,P0.001。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明,本發(fā)明方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒具有顯著相關(guān)性。綜上所述,本論文一方面初步闡明了本研究研制的CEA磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑、AFP及Free β-hCG雙標(biāo)記磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑的各項(xiàng)指標(biāo)(準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度、特異性等)均滿足臨床檢測(cè)試劑要求,臨床評(píng)測(cè)結(jié)果與進(jìn)口產(chǎn)品性能相近,有望通過優(yōu)化后應(yīng)用于生產(chǎn),同時(shí)將進(jìn)一步開發(fā)臨床疾病標(biāo)志物的試劑。另一方面初步闡明了利用磁珠作為固相載體應(yīng)用于時(shí)間分辨熒光免疫分析能夠提高檢測(cè)靈敏度,擴(kuò)大線性范圍,縮短分析時(shí)間,提高檢測(cè)效率等優(yōu)點(diǎn),有望進(jìn)一步將其應(yīng)用到多元分析中,在臨床分子診斷和食品檢測(cè)等生物化學(xué)分析中具有非常重要的意義。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R446.6
【部分圖文】：

圖３?ＤＥＬＦＩＡ?xí)r間分辨癸光免疲分析法原理圖??Ｆｉｇ．３?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ＤＥＬＦＩＡ?ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ?ｆｌｕｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ??根據(jù)各銅系離子的巧光波長(zhǎng)及衰減時(shí)間差異很大的特點(diǎn)，可ｗ對(duì)多種標(biāo)記??的銅系離子的英光同時(shí)進(jìn)行測(cè)量Ｗ檢測(cè)樣品中的多種祀標(biāo)，Ｗ實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記英光??免疫分析。在雙重標(biāo)記分析中，Ｅｕ３＋和Ｓｍ３＋是較為經(jīng)典的一對(duì)銅系稀±離子，Ｅｕ３＋??和Ｔｂ３＋是另一對(duì)常用雙標(biāo)記分析的銅系離子Ｐｇｊ。上個(gè)世紀(jì)９０年代，Ｘｕ等開發(fā)出??的共用巧光增強(qiáng)液ＰＷ，用這種方法可Ｗ從新生兒少量的血樣本中同時(shí)查出四個(gè)??有價(jià)值的相關(guān)疾病指標(biāo)，充分顯示了多標(biāo)記分析的省時(shí)、省為和省試劑的特點(diǎn)，??在檢測(cè)多種分子的篩查實(shí)驗(yàn)和一些珍貴樣品的檢測(cè)具有廣闊的應(yīng)用前景。??稀±元素作為金屬離子，很難直接巧抗原抗體結(jié)合，因此在標(biāo)記時(shí)需要有??一種雙功能基團(tuán)的藝合物，它們分子內(nèi)或帶氨基和袋基或帶有異硫幫酸基，和??殘酸基，一端與稀±離子連接，一端與抗原或抗體的自由氨基連接。此外，關(guān)??

兩步法比一步法增加了反應(yīng)步驟，但優(yōu)點(diǎn)是使免疫反應(yīng)更充信號(hào)值有所提高，抑制效應(yīng)（Ｈｏｏｋ）出現(xiàn)較晩。??表１－３最佳反應(yīng)模式??Ｔａｂ．?１?－３?Ｏｐｔｉｍａｌ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｏｄｅ??反應(yīng)模式?一步法巧光值?兩步法巧光值??Ａ?９６１?１１３０??Ｂ?４５０６?４７２３??稱準(zhǔn)品?Ｃ?１６７７６?１９７６４??Ｄ?３５１２４?３９１２１??Ｅ?４５１３１３?４７５７１８??Ｆ?２１６４５８０?２２１３５９８??

Ｗ?Ｐｅｒｋｉ證Ｉｍｅｒ?Ｗａｌｌａｃ公司微孔板式ＴＲＦＩＡ測(cè)定的濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分??析（Ｏｒｉｇｉｎ?Ｐｒｏ７．５?Ｍｉｃｒｏｃａｌ，ＵＳＡ），相關(guān)方程為：Ｙ＝?１．０４９Ｘ＋１．６９６，?（ｒ２＝０．９７０，??Ｐ＜０．００１），見圖１－９Ａ。Ｗ自制試劑盒測(cè)定血樣的ＣＥＡ濃度結(jié)果為橫坐標(biāo)，Ｗ雅培公??司化學(xué)發(fā)光測(cè)定的ＣＥＡ濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析，相關(guān)方程為：Ｙ＝??０．８７３Ｘ－３．８０２
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 林文濤;鄢盛愷;王海蛟;張向輝;趙衛(wèi)國(guó);;標(biāo)記免疫分析及其分析儀器的進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)療器械信息;2010年12期

本文編號(hào)：2858258