【摘要】：目的采用原核表達系統(tǒng)表達水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)糖蛋白E(g E)基因的胞外域,將純化后的目的蛋白免疫新西蘭家兔,制備該蛋白特異性抗血清。方法構建原核表達質粒g E-p ET-32a(+),測序后將其轉化至E.coli BL21,以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導,獲得VZV g E融合蛋白。采用SDS-PAGE電泳、Western blot法鑒定其特異性,利用Ni2+-NTA柱對g E蛋白進行純化,復性后免疫新西蘭家兔,獲得兔抗VZV g E血清;采用間接免疫熒光、Western blot法和ELISA法檢測該血清的特異性和效價。結果成功誘導表達出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鑒定提示其主要為包涵體表達,濃度約為3.01 mg/ml。蛋白經Ni2+-NTA柱純化后,純度約為90%。Western blot法顯示,經變性、復性后的該融合蛋白有良好的免疫反應性。用該蛋白免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E血清。ELISA分析顯示,該兔抗血清的效價為1∶6 400。結論成功構建了高效表達VZV g E蛋白的原核表達系統(tǒng),獲得較高純度的g E蛋白,可以作為VZV亞單位疫苗的候選抗原,制備了特異性及效價均較高的兔抗VZV g E多克隆抗體,為VZV感染的臨床診斷及治療提供了重要的實驗工具。
【圖文】：

量一致，表明融合蛋白主要以包涵體形式存在。見圖2A。圖1VZVgE基因胞外域PCＲ擴增和gE-pET-32a(+)酶切鑒定A:VZVgE基因胞外域PCＲ擴增圖;B:重組質粒單、雙酶切鑒定圖;M:Marker;1:目的基因片段;2:陰性對照;3:重組質粒;4:重組質粒經XholI酶切;5:重組質粒經HandⅢ酶切;6:重組質粒經雙酶切2．3VZVgE融合蛋白的復性、純化及鑒定取純化后的融合蛋白進行SDS-PAGE鑒定，軟件分析顯示，其純度約為90%，見圖2B。Lowry法測定融合蛋白的濃度為3．01mg/ml。應用鼠抗VZVgE單克隆抗體進行Westernblot鑒定，結果可見約73ku的特異性目的條帶。見圖2C。圖2VZVgE融合蛋白經SDS-PAGE和Westernblot特異性鑒定A:融合蛋白的可溶性SDS-PAGE鑒定圖;B:純化后的融合蛋白SDS-PAGE鑒定圖;C:融合蛋白的Westernblot分析;M:Marker;1:重組菌體破碎前總蛋白;2:重組菌體破碎后上清液;3:重組菌體破碎后包涵體;4:pET-32空載體對照;5:純化前gE融合蛋白;6:純化后gE融合蛋白;7:純化前gE融合蛋白;8:純化后gE融合蛋白;9:pET-32空載體對照;10:BL21空菌對照2．4兔抗VZVgE多克隆抗體ELISA法效價檢測結果采用ELISA法檢測，結果顯示，免疫前兔陰性血清OD值為(0.253±0.037)，當免疫后血清最大稀釋度達1∶6400時，其OD值為0.382＞s藊+3S，采用配對t檢驗分析，與免疫前兔陰性血清組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，即多克隆抗體效價為1∶6400。見圖3。2．5兔抗VZVgE多克隆抗體特異性鑒定采用間接免疫熒光法和Westernblot分析兔抗VZVgE多克隆抗體的特異性。結果顯示，gE蛋白免疫血清僅在感染VZV的HF細胞上呈現(xiàn)典型的綠色熒光，在其他皰疹病毒感染的細胞中都不出現(xiàn)熒光。見圖圖3ELISA法分析兔血清中VZVgE抗體效價1:血清1∶200稀釋度;2:血清1∶400稀釋度;3:血清1∶800稀釋

白主要以包涵體形式存在。見圖2A。圖1VZVgE基因胞外域PCＲ擴增和gE-pET-32a(+)酶切鑒定A:VZVgE基因胞外域PCＲ擴增圖;B:重組質粒單、雙酶切鑒定圖;M:Marker;1:目的基因片段;2:陰性對照;3:重組質粒;4:重組質粒經XholI酶切;5:重組質粒經HandⅢ酶切;6:重組質粒經雙酶切2．3VZVgE融合蛋白的復性、純化及鑒定取純化后的融合蛋白進行SDS-PAGE鑒定，軟件分析顯示，，其純度約為90%，見圖2B。Lowry法測定融合蛋白的濃度為3．01mg/ml。應用鼠抗VZVgE單克隆抗體進行Westernblot鑒定，結果可見約73ku的特異性目的條帶。見圖2C。圖2VZVgE融合蛋白經SDS-PAGE和Westernblot特異性鑒定A:融合蛋白的可溶性SDS-PAGE鑒定圖;B:純化后的融合蛋白SDS-PAGE鑒定圖;C:融合蛋白的Westernblot分析;M:Marker;1:重組菌體破碎前總蛋白;2:重組菌體破碎后上清液;3:重組菌體破碎后包涵體;4:pET-32空載體對照;5:純化前gE融合蛋白;6:純化后gE融合蛋白;7:純化前gE融合蛋白;8:純化后gE融合蛋白;9:pET-32空載體對照;10:BL21空菌對照2．4兔抗VZVgE多克隆抗體ELISA法效價檢測結果采用ELISA法檢測，結果顯示，免疫前兔陰性血清OD值為(0.253±0.037)，當免疫后血清最大稀釋度達1∶6400時，其OD值為0.382＞s藊+3S，采用配對t檢驗分析，與免疫前兔陰性血清組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，即多克隆抗體效價為1∶6400。見圖3。2．5兔抗VZVgE多克隆抗體特異性鑒定采用間接免疫熒光法和Westernblot分析兔抗VZVgE多克隆抗體的特異性。結果顯示，gE蛋白免疫血清僅在感染VZV的HF細胞上呈現(xiàn)典型的綠色熒光，在其他皰疹病毒感染的細胞中都不出現(xiàn)熒光。見圖圖3ELISA法分析兔血清中VZVgE抗體效價1:血清1∶200稀釋度;2:血清1∶400稀釋度;3:血清1∶800稀釋度;4:血清1∶1600稀

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