【摘要】：目的:微粒(MPs)作為細(xì)胞釋放的一種“亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)”已經(jīng)在自身免疫等多種疾病中被發(fā)現(xiàn)。已有研究表明MPs可打破免疫耐受,觸發(fā)自身免疫應(yīng)答。本研究旨在通過(guò)對(duì)MPs分析前影響因素的研究,建立一種MPs定量檢測(cè)的優(yōu)化平臺(tái),同時(shí)針對(duì)血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MPs的研究,探討其免疫刺激作用的發(fā)揮。方法:1.MPs定量檢測(cè)方法及影響因素的分析(1)選取蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院SLE、RA及年齡和性別相匹配健康對(duì)照者(HC)各20例;(2)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和Bradford蛋白定量?jī)煞N方法分別檢測(cè)20例SLE患者血漿中總MPs的含量,并對(duì)比分析這兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性;(3)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)不同抗凝劑[枸櫞酸鹽,乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2),肝素]和無(wú)抗凝劑血漿中總MPs的含量;(4)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)不同標(biāo)本洗滌方式[洗滌貧血小板血漿(洗滌PPP)和直接貧血小板血漿(直接PPP)]下血漿中總MPs的含量;(5)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)不同保存溫度(4,-20,-80℃)和時(shí)間(1,3,7,10,14d)條件下血漿中總MPs的含量。2.MPs體外免疫學(xué)功能的檢測(cè)(1)血漿中MPs的免疫學(xué)功能a.選取蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院及門診SLE患者28例、RA患者29例及年齡和性別相匹配HC 40例;b.流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)SLE、RA及HC血漿中總MPs、LDMPs和MDMPs的含量;c.選取SLE、RA及HC患者各三例,將新鮮EDTA-K2抗凝血漿經(jīng)過(guò)離心洗滌制成含有MPs的洗滌貧血小板血漿(洗滌PPP),然后體外與PBMC共孵育48h,CBA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的分泌情況。(2)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MPs的免疫學(xué)功能a.采用LPS、CAM及STS刺激THP-1細(xì)胞活化或凋亡;采用PMA+PHA、CAM及STS刺激Jurkat細(xì)胞活化或凋亡,同時(shí)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)這兩種細(xì)胞株刺激前及刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MPs的釋放情況;b.將凋亡THP-1細(xì)胞來(lái)源的單核細(xì)胞微粒(MDMPs)按照低、中和高濃度(10,20和40μg/m L)分別與Jurkat和PBMC細(xì)胞體外共培養(yǎng)14h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞表面中晚期活化分子CD71的表達(dá)情況;c.將凋亡THP-1細(xì)胞來(lái)源的單核細(xì)胞微粒(MDMPs)按照低、中和高濃度(10,20和40μg/m L)分別與Jurkat和PBMC細(xì)胞體外共培養(yǎng)48h,CBA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的分泌情況。結(jié)果:1.MPs定量檢測(cè)方法及影響因素的分析(1)流式細(xì)胞術(shù)法和Bradford蛋白定量法檢測(cè)血漿中總MPs含量之間存在較高的相關(guān)性(r=0.597,P0.01);(2)枸櫞酸鹽抗凝血漿中總MPs含量最多(F=25.04,P0.01),與EDTA-K2、肝素及無(wú)抗凝劑血漿中總MPs含量相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);(3)SLE、RA和HC三組血漿直接PPP中總MPs含量均高于洗滌PPP中總MPs含量(均P0.05);(4)與相同保存溫度下保存0d即新鮮血漿中總MPs含量比較,4℃,-20℃和-80℃三個(gè)溫度下分別保存1,3,7,10d血漿中總MPs含量逐漸下降(均P0.05);而三個(gè)溫度下分別保存14d血漿中總MPs含量逐漸升高,與相同保存溫度保存0d的新鮮血漿中總MPs含量比較無(wú)明顯差異。分別對(duì)三個(gè)溫度下相同保存時(shí)間血漿中總MPs含量?jī)蓛杀容^結(jié)果顯示,新鮮血漿標(biāo)本于4℃,-20℃和-80℃條件下分別放置1,3,7,10和14d血漿中總MPs含量無(wú)明顯差異(均P0.05)。2.MPs體外免疫學(xué)功能的檢測(cè)(1)血漿中MPs的免疫學(xué)功能a.SLE、RA患者血漿中總MPs、LDMPs及MDMPs含量均高于HC(均P0.05);b.與健康對(duì)照者(HC)相比,SLE患者血漿中MPs能刺激PBMC分泌IL-6、TNF、IFN-γ(均P0.05),RA患者血漿中MPs能促進(jìn)PBMC分泌IL-6(P0.05)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MPs的免疫學(xué)功能a.THP-1細(xì)胞組:與未加刺激的對(duì)照組相比,CAM和STS均能刺激THP-1細(xì)胞釋放單核細(xì)胞微粒(MDMPs)(均P0.05),而LPS能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放MDMPs,但無(wú)明顯差異(P0.05);Jurkat細(xì)胞組:與未加刺激劑的對(duì)照組相比,STS、CAM和PMA+PHA均能刺激Jurkat細(xì)胞釋放淋巴細(xì)胞微粒(LDMPs)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);b.與陰性對(duì)照組相比,20μg/m L和40μg/m L MDMPs均能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞表面CD71分子表達(dá)水平增加(均P0.05),且隨MDMPs濃度的增加而表達(dá)水平增高;(10,20和40μg/m L)MDMPs均能刺激PBMC細(xì)胞表面CD71分子表達(dá)水平增加(均P0.05),且隨MDMPs濃度的增加而表達(dá)率升高;c.與陰性對(duì)照組相比,(10,20和40μg/m L)MDMPs均能刺激PBMC IL-10的分泌(均P0.05),同時(shí)40μg/m L MDMPs還能促進(jìn)PBMC IFN-γ的分泌(P0.01),此外,不同濃度MDMPs還能誘導(dǎo)PBMC大量分泌IL-6,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);20μg/m L和40μg/m L MDMPs能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞IL-6的分泌(均P0.05),而10μg/m L MDMPs無(wú)此現(xiàn)象。結(jié)論:(1)血漿中MPs含量的檢測(cè)應(yīng)優(yōu)先選用新鮮EDTA-K2抗凝血漿且不可多次離心洗滌,而且新鮮血漿標(biāo)本在4℃,-20℃和-80℃條件下保存2周內(nèi)對(duì)血漿中總MPs含量的檢測(cè)無(wú)影響;(2)凋亡THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液來(lái)源的MDMPs可活化刺激T細(xì)胞表面中晚期活化分子CD71的表達(dá);(3)血漿中MPs和凋亡THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液來(lái)源的MPs均可刺激T細(xì)胞分泌IL-6、IL-10、TNF及IFN-γ等Th1/Th2型細(xì)胞因子。
【圖文】：

圖 1-1 前向散射(FSC)及側(cè)向散射(SSC) MPs“門”的設(shè)定Fig. 1-1 Establishment of MPs -gate by size in a forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) plot注:A, 過(guò)濾 PBS 作為空白對(duì)照, 排除背景噪音干擾, 作為 MPs 門的檢測(cè)下限; B, 1μm 標(biāo)準(zhǔn)微球位置, 作為 MPs 門的檢測(cè)上限; C, MPs 的位置即為<1μm(Note: A, Buffer noise was left out by the MPs-gate; B, 1μm calibration beads was set as theupper limit for MPs detection; C, MPs-gate size was setted <1μm)3.2 流式細(xì)胞術(shù)法和 Bradford 蛋白定量法檢測(cè)血漿中總 MPs 含量的對(duì)比分析以 BSA（牛血清白蛋白）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制了 Bradford 蛋白定量法標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程為 y=602.9x+5.243，r2=0.999。為了對(duì)比分析流式細(xì)胞術(shù)和 Bradford 蛋白定量法對(duì)血漿中總 MPs 含量的檢測(cè)是否有相關(guān)性，同時(shí)為了避免血漿中蛋白成分對(duì)Bradford 蛋白定量法對(duì)血漿中總 MPs 含量檢測(cè)的影響，我們選取 20 名 SLE 患者新鮮EDTA-K2抗凝血漿。經(jīng)過(guò)離心洗滌制成含有 MPs 的洗滌 PPP，采用上述兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示流式細(xì)胞術(shù)法[（6681±474）個(gè)/μL]和 Bradford 蛋白定量法（[2.69±0.17）μg/μL]對(duì)血漿總 MPs 含量的檢測(cè)之間存在較高相關(guān)性（r=0.597，P<0.01），

第一部分 微粒（MPs）定量檢測(cè)方法、條件的建立及其免疫學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)研究3.3 不同抗凝劑來(lái)源的血漿中總 MPs 含量的檢測(cè)結(jié)果針對(duì) 6 名健康人不同抗凝劑來(lái)源血漿樣本中總 MPs 含量進(jìn)行檢測(cè)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，，枸櫞酸鹽、EDTA-K2、肝素抗凝劑和無(wú)抗凝劑血漿中總 MPs 含量分別為[（3657±353）個(gè)/μL、（3107±238）個(gè)/μL、（1978±176）個(gè)/μL 和（1176±106）個(gè)/μL]，四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.04，P<0.01）。與枸櫞酸鹽抗凝血漿中總 MPs 含量比較，EDTA-K2、肝素及無(wú)抗凝劑血漿中總 MPs 含量少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P<0.05）；其中無(wú)抗凝劑血漿中總 MPs 含量最少，與 EDTA-K2和肝素抗凝血漿中總 MPs 含量相比較有顯著性差異（均 P<0.01）。如圖 1-3 所示。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.6

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 馬文新,崔巍,侯百東,林其燧;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板微粒及其臨床應(yīng)用的初探[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2000年05期

2 周婷君;馬江敏;張世玉;莫雪垠;范媛;;T淋巴細(xì)胞表面活化分子表達(dá)及其活化相關(guān)影響因子[J];口腔生物醫(yī)學(xué);2014年02期

本文編號(hào)：2547393