【摘要】：研究背景與目的:缺血性組織損傷是臨床缺血性疾病中常見的病理過程,缺血性心臟病、缺血性腦血管病及缺血性外周血管病等都可因缺血缺氧而造成組織器官的功能受損,盡快恢復(fù)缺血組織的血液供給有助于各種缺血性損傷的修復(fù)。近年來,利用干細(xì)胞移植修復(fù)缺血性組織損傷的相關(guān)研究十分活躍,由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)分化而來的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)展現(xiàn)出較成體MSCs更強(qiáng)大的減輕缺血性組織損傷,促進(jìn)缺血組織血管新生及功能恢復(fù)的功能,因而在干細(xì)胞治療領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。但是,干細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床治療始終存在一定風(fēng)險(xiǎn),如遺傳物質(zhì)變異、移植細(xì)胞栓塞血管和致瘤致畸等。最新研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞主要通過旁分泌機(jī)制發(fā)揮其治療功能,而外泌體是其中一種重要的旁分泌因子。外泌體是細(xì)胞分泌的一種直徑約40~100nm的囊泡,其內(nèi)包裹有來源細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)、miRNAs等物質(zhì),在缺血性損傷組織內(nèi)直接移植干細(xì)胞來源外泌體可以發(fā)揮類似移植干細(xì)胞樣的修復(fù)組織損傷的作用。因此,由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化形成的間充質(zhì)干細(xì)胞(iPSCs-MSCs,iMSCs)來源的外泌體(iMSCs-exosome,iMSC-Exo)是否具有強(qiáng)大的修復(fù)缺血性損傷的功能值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立下肢缺血模型及腦缺血模型模擬人體常見的外周及中樞系統(tǒng)缺血性疾病,在此基礎(chǔ)上觀察iMSC-Exo對缺血下肢及缺血腦組織的修復(fù)作用,并分析是否通過促進(jìn)缺血組織的血管新生發(fā)揮此修復(fù)功能,隨后體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析其促血管新生的功能及可能的機(jī)制。通過此項(xiàng)研究,以期為缺血性疾病的治療提供一條新模式。研究內(nèi)容和方法:1.iPSCs向MSCs定向分化及iMSC-Exo的富集1.1 iPSCs向MSCs定向分化:采用一步法將iPSCs定向分化為MSCs;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各細(xì)胞多能干性基因及中胚層基因表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)鑒定iMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá);采用經(jīng)典的成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)法檢測iMSCs的多向分化潛能。1.2imsc-exo的富集與鑒定:無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)imscs48h,超速離心法收集imsc-exo;透射電鏡觀察imsc-exo的形態(tài);高分辨率可調(diào)電阻脈沖技術(shù)確定imsc-exo的直徑;westernblot鑒定imsc-exo的特異標(biāo)志物。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察imsc-exo對缺血組織的修復(fù)作用及對血管新生的影響2.1imsc-exo對缺血下肢的修復(fù)作用及對血管新生的影響2.1.1建立小鼠下肢缺血模型(hind-limbischemia,hli),股四頭肌內(nèi)多點(diǎn)注射法移植imsc-exo。2.1.2缺血下肢梗死程度的比較及缺血肌肉細(xì)胞形態(tài)變化:統(tǒng)計(jì)術(shù)后21天各組小鼠缺血下肢梗死程度:完整,壞疽,截肢;he染色比較術(shù)后21天各組缺血股四頭肌細(xì)胞形態(tài)變化。2.1.3激光多普勒檢測術(shù)后1、7、14、21天缺血下肢血流恢復(fù)程度。2.1.4缺血股四頭肌冰凍切片cd31及cd34染色比較各組術(shù)后14天和21天缺血肌肉內(nèi)微血管密度變化。2.2imsc-exo對缺血腦組織的修復(fù)作用及對血管新生的影響2.2.1建立大鼠大腦中動脈栓塞模型(middlecerebralarteryocclusion,mcao),尾靜脈移植imsc-exo。2.2.2利用mnss評分系統(tǒng)觀察術(shù)前,術(shù)后1、3、7、14、21、28天大鼠神經(jīng)功能改善狀況;ttc染色比較術(shù)后1天及術(shù)后28天各組腦組織梗死程度。2.2.3移植后分別30min、1h、6h檢測imsc-exo缺血腦組織內(nèi)定位及細(xì)胞內(nèi)定位。2.2.4冰凍切片cd31及cd34染色比較各組術(shù)后14天和28天缺血腦組織內(nèi)微血管密度變化。3.體外研究分析imsc-exo促血管新生的機(jī)制3.1原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells,huvecs)的分離培養(yǎng)與鑒定。3.2免疫熒光雙染法觀察huvecs內(nèi)吞imsc-exo的效率。3.3imsc-exo促進(jìn)huvecs遷移、增殖和成管:rtca法及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測huvecs的遷移能力;cck8法檢測huvecs的增殖能力;體外基質(zhì)膠法檢測huvecs的成管能力。3.4imsc-exo促進(jìn)huvecs表達(dá)血管新生相關(guān)分子:qrt-pcr及elisa分別檢測不同濃度imsc-exo刺激huvecs24h及48h,其表達(dá)的血管新生相關(guān)基因及分泌的血管新生相關(guān)蛋白的水平。3.5mirnas芯片檢測imsc-exo內(nèi)的mirnas,分析其中高豐度表達(dá)的與血管新生有關(guān)的mirnas。結(jié)果:1.成功誘導(dǎo)形成imscs及富集imsc-exo1.1成功建立體外ipscs向mscs定向分化的方法,imscs呈典型的長梭形;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞表型cd29、cd44、cd73、cd90、cd105及cd146表達(dá)陽性,cd34、cd45、cd133及hla-dr表達(dá)陰性,符合典型的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征;qrt-pcr顯示imscs不表達(dá)多能干性基因nanog及oct4。多向分化結(jié)果顯示imscs具有成骨分化、成脂分化及成軟骨分化的能力。1.2采用超速離心法成功富集imsc-exo;透射電鏡顯示imsc-exo呈圓形或半圓形,直徑40nm~100nm;高分辨率可調(diào)電阻脈沖技術(shù)顯示imsc-exo直徑中位數(shù)為84nm,平均直徑122nm;westernblot檢測結(jié)果表明imsc-exo表達(dá)cd9、cd63和cd81分子,符合間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的特征。2.imsc-exo修復(fù)缺血組織并促進(jìn)缺血組織內(nèi)的血管新生2.1imsc-exo修復(fù)缺血下肢并促進(jìn)血管新生:統(tǒng)計(jì)術(shù)后21天各組缺血下肢梗死程度,結(jié)果顯示假手術(shù)組小鼠下肢全部存活,無截肢及壞疽;control組小鼠下肢壞疽及截肢明顯,70%出現(xiàn)截肢,20%出現(xiàn)嚴(yán)重的壞疽,只有10%下肢完整;imsc-exo組小鼠有10%出現(xiàn)了截肢,25%出現(xiàn)了壞疽,65%肢體完整。he染色結(jié)果顯示術(shù)后21天,假手術(shù)組肌肉細(xì)胞完整,飽滿,無明顯凋亡;imsc-exo組肌肉細(xì)胞萎縮,出現(xiàn)凋亡,而control組肌肉細(xì)胞萎縮及凋亡程度均較imsc-exo組明顯加重。激光多普勒結(jié)果顯示術(shù)后imsc-exo組缺血下肢血流逐漸恢復(fù),第14天和第21天下肢血流較術(shù)后0天明顯改善。而術(shù)后control組下肢血流無明顯改善,14天后可見有截肢現(xiàn)象。免疫熒光cd31及cd34染色結(jié)果顯示14天和21天cd31陽性細(xì)胞數(shù)分別是control組的3.14、3.46倍,cd34陽性細(xì)胞數(shù)分別是control組的2.64、3.01倍。2.2imsc-exo修復(fù)缺血腦組織并促進(jìn)血管新生:尾靜脈移植imsc-exo,imsc-exo組與control組神經(jīng)功能在術(shù)后1、3、7天無明顯差異,而術(shù)后14、21、28天,imsc-exo組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)狀況要明顯好于control組。ttc染色結(jié)果顯示:imsc-exo能減少腦梗死組織的梗死體積。尾靜脈移植綠色熒光標(biāo)記iMSC-Exo,30min后即可見缺血腦組織內(nèi)有iMSC-Exo分布,6h可見大量iMSC-Exo分布于缺血腦組織內(nèi),移植后6h在血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)均可見iMSC-Exo分布。免疫熒光CD31及CD34染色結(jié)果顯示14天和28天CD31陽性細(xì)胞數(shù)分別是Control組的3.01、1.99倍,CD34陽性細(xì)胞數(shù)分別是Control組的2.46、2.05倍。3.iMSC-Exo具有體外促血管新生能力iMSC-Exo與HUVECs的共培養(yǎng)結(jié)果顯示HUVECs能夠內(nèi)吞iMSC-Exo,內(nèi)吞量隨時(shí)間增加而增大。RTCA及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示iMSC-Exo可明顯促進(jìn)HUVECs的遷移。CCK8結(jié)果顯示iMSC-Exo能夠明顯促進(jìn)HUVECs的增殖。體外基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示iMSC-Exo能夠促進(jìn)HUVECs成管。qRT-PCR顯示iMSC-Exo能促進(jìn)HUVECs內(nèi)血管新生相關(guān)基因的表達(dá),ELISA顯示iMSC-Exo能促進(jìn)HUVECs分泌血管新生相關(guān)蛋白。miRNAs芯片結(jié)果顯示iMSC-Exo內(nèi)含有32種血管新生相關(guān)的miRNAs,并且高豐度表達(dá)mi R210、miR126、miR103、miR424、miR378、let-7α、let-7e這7種促血管新生miRNAs。結(jié)論:1.缺血下肢內(nèi)局部移植iMSC-Exo能夠減輕缺血下肢的損傷,促進(jìn)缺血下肢的功能恢復(fù);尾靜脈移植iMSC-Exo能夠減輕缺血腦組織的損傷并促進(jìn)缺血腦組織的功能恢復(fù)。2.局部移植iMSC-Exo能夠促進(jìn)缺血下肢肌肉內(nèi)的血管新生;尾靜脈移植iMSC-Exo能夠促進(jìn)缺血腦組織內(nèi)的血管新生。3.iMSC-Exo干預(yù)能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的HUVECs的遷移、增殖及成管,并能夠促進(jìn)HUVECs內(nèi)血管新生相關(guān)基因的表達(dá)及蛋白的分泌。4.iMSC-Exo內(nèi)高豐度表達(dá)多種血管新生相關(guān)性miRNAs,這些miRNAs可能參與iMSC-Exo的促血管新生功能。本研究結(jié)果表明,iMSC-Exo主要通過促進(jìn)血管新生,提高缺血組織內(nèi)的血流灌注,從而減輕缺血性組織損傷,并促進(jìn)損傷組織的功能恢復(fù)。提示iMSC-Exo移植有望成為一種替代干細(xì)胞治療缺血性組織損傷的新策略。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R457.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2532360