【摘要】：研究背景與目的:缺血性組織損傷是臨床缺血性疾病中常見的病理過程,缺血性心臟病、缺血性腦血管病及缺血性外周血管病等都可因缺血缺氧而造成組織器官的功能受損,盡快恢復缺血組織的血液供給有助于各種缺血性損傷的修復。近年來,利用干細胞移植修復缺血性組織損傷的相關研究十分活躍,由誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)分化而來的間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)展現(xiàn)出較成體MSCs更強大的減輕缺血性組織損傷,促進缺血組織血管新生及功能恢復的功能,因而在干細胞治療領域展現(xiàn)了良好的應用前景。但是,干細胞移植應用于臨床治療始終存在一定風險,如遺傳物質變異、移植細胞栓塞血管和致瘤致畸等。最新研究發(fā)現(xiàn)干細胞主要通過旁分泌機制發(fā)揮其治療功能,而外泌體是其中一種重要的旁分泌因子。外泌體是細胞分泌的一種直徑約40~100nm的囊泡,其內包裹有來源細胞內的多種蛋白質、miRNAs等物質,在缺血性損傷組織內直接移植干細胞來源外泌體可以發(fā)揮類似移植干細胞樣的修復組織損傷的作用。因此,由誘導多能干細胞分化形成的間充質干細胞(iPSCs-MSCs,iMSCs)來源的外泌體(iMSCs-exosome,iMSC-Exo)是否具有強大的修復缺血性損傷的功能值得深入研究。本實驗通過建立下肢缺血模型及腦缺血模型模擬人體常見的外周及中樞系統(tǒng)缺血性疾病,在此基礎上觀察iMSC-Exo對缺血下肢及缺血腦組織的修復作用,并分析是否通過促進缺血組織的血管新生發(fā)揮此修復功能,隨后體外實驗進一步分析其促血管新生的功能及可能的機制。通過此項研究,以期為缺血性疾病的治療提供一條新模式。研究內容和方法:1.iPSCs向MSCs定向分化及iMSC-Exo的富集1.1 iPSCs向MSCs定向分化:采用一步法將iPSCs定向分化為MSCs;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各細胞多能干性基因及中胚層基因表達水平;流式細胞術鑒定iMSCs表面標志物的表達;采用經典的成骨、成脂、成軟骨誘導法檢測iMSCs的多向分化潛能。1.2imsc-exo的富集與鑒定:無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)imscs48h,超速離心法收集imsc-exo;透射電鏡觀察imsc-exo的形態(tài);高分辨率可調電阻脈沖技術確定imsc-exo的直徑;westernblot鑒定imsc-exo的特異標志物。2.體內實驗觀察imsc-exo對缺血組織的修復作用及對血管新生的影響2.1imsc-exo對缺血下肢的修復作用及對血管新生的影響2.1.1建立小鼠下肢缺血模型(hind-limbischemia,hli),股四頭肌內多點注射法移植imsc-exo。2.1.2缺血下肢梗死程度的比較及缺血肌肉細胞形態(tài)變化:統(tǒng)計術后21天各組小鼠缺血下肢梗死程度:完整,壞疽,截肢;he染色比較術后21天各組缺血股四頭肌細胞形態(tài)變化。2.1.3激光多普勒檢測術后1、7、14、21天缺血下肢血流恢復程度。2.1.4缺血股四頭肌冰凍切片cd31及cd34染色比較各組術后14天和21天缺血肌肉內微血管密度變化。2.2imsc-exo對缺血腦組織的修復作用及對血管新生的影響2.2.1建立大鼠大腦中動脈栓塞模型(middlecerebralarteryocclusion,mcao),尾靜脈移植imsc-exo。2.2.2利用mnss評分系統(tǒng)觀察術前,術后1、3、7、14、21、28天大鼠神經功能改善狀況;ttc染色比較術后1天及術后28天各組腦組織梗死程度。2.2.3移植后分別30min、1h、6h檢測imsc-exo缺血腦組織內定位及細胞內定位。2.2.4冰凍切片cd31及cd34染色比較各組術后14天和28天缺血腦組織內微血管密度變化。3.體外研究分析imsc-exo促血管新生的機制3.1原代人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells,huvecs)的分離培養(yǎng)與鑒定。3.2免疫熒光雙染法觀察huvecs內吞imsc-exo的效率。3.3imsc-exo促進huvecs遷移、增殖和成管:rtca法及劃痕實驗檢測huvecs的遷移能力;cck8法檢測huvecs的增殖能力;體外基質膠法檢測huvecs的成管能力。3.4imsc-exo促進huvecs表達血管新生相關分子:qrt-pcr及elisa分別檢測不同濃度imsc-exo刺激huvecs24h及48h,其表達的血管新生相關基因及分泌的血管新生相關蛋白的水平。3.5mirnas芯片檢測imsc-exo內的mirnas,分析其中高豐度表達的與血管新生有關的mirnas。結果:1.成功誘導形成imscs及富集imsc-exo1.1成功建立體外ipscs向mscs定向分化的方法,imscs呈典型的長梭形;流式細胞術結果顯示細胞表型cd29、cd44、cd73、cd90、cd105及cd146表達陽性,cd34、cd45、cd133及hla-dr表達陰性,符合典型的間充質干細胞的特征;qrt-pcr顯示imscs不表達多能干性基因nanog及oct4。多向分化結果顯示imscs具有成骨分化、成脂分化及成軟骨分化的能力。1.2采用超速離心法成功富集imsc-exo;透射電鏡顯示imsc-exo呈圓形或半圓形,直徑40nm~100nm;高分辨率可調電阻脈沖技術顯示imsc-exo直徑中位數為84nm,平均直徑122nm;westernblot檢測結果表明imsc-exo表達cd9、cd63和cd81分子,符合間充質干細胞外泌體的特征。2.imsc-exo修復缺血組織并促進缺血組織內的血管新生2.1imsc-exo修復缺血下肢并促進血管新生:統(tǒng)計術后21天各組缺血下肢梗死程度,結果顯示假手術組小鼠下肢全部存活,無截肢及壞疽;control組小鼠下肢壞疽及截肢明顯,70%出現(xiàn)截肢,20%出現(xiàn)嚴重的壞疽,只有10%下肢完整;imsc-exo組小鼠有10%出現(xiàn)了截肢,25%出現(xiàn)了壞疽,65%肢體完整。he染色結果顯示術后21天,假手術組肌肉細胞完整,飽滿,無明顯凋亡;imsc-exo組肌肉細胞萎縮,出現(xiàn)凋亡,而control組肌肉細胞萎縮及凋亡程度均較imsc-exo組明顯加重。激光多普勒結果顯示術后imsc-exo組缺血下肢血流逐漸恢復,第14天和第21天下肢血流較術后0天明顯改善。而術后control組下肢血流無明顯改善,14天后可見有截肢現(xiàn)象。免疫熒光cd31及cd34染色結果顯示14天和21天cd31陽性細胞數分別是control組的3.14、3.46倍,cd34陽性細胞數分別是control組的2.64、3.01倍。2.2imsc-exo修復缺血腦組織并促進血管新生:尾靜脈移植imsc-exo,imsc-exo組與control組神經功能在術后1、3、7天無明顯差異,而術后14、21、28天,imsc-exo組大鼠神經功能恢復狀況要明顯好于control組。ttc染色結果顯示:imsc-exo能減少腦梗死組織的梗死體積。尾靜脈移植綠色熒光標記iMSC-Exo,30min后即可見缺血腦組織內有iMSC-Exo分布,6h可見大量iMSC-Exo分布于缺血腦組織內,移植后6h在血管內皮細胞、神經元、神經干細胞內均可見iMSC-Exo分布。免疫熒光CD31及CD34染色結果顯示14天和28天CD31陽性細胞數分別是Control組的3.01、1.99倍,CD34陽性細胞數分別是Control組的2.46、2.05倍。3.iMSC-Exo具有體外促血管新生能力iMSC-Exo與HUVECs的共培養(yǎng)結果顯示HUVECs能夠內吞iMSC-Exo,內吞量隨時間增加而增大。RTCA及劃痕實驗結果均顯示iMSC-Exo可明顯促進HUVECs的遷移。CCK8結果顯示iMSC-Exo能夠明顯促進HUVECs的增殖。體外基質膠成管實驗結果顯示iMSC-Exo能夠促進HUVECs成管。qRT-PCR顯示iMSC-Exo能促進HUVECs內血管新生相關基因的表達,ELISA顯示iMSC-Exo能促進HUVECs分泌血管新生相關蛋白。miRNAs芯片結果顯示iMSC-Exo內含有32種血管新生相關的miRNAs,并且高豐度表達mi R210、miR126、miR103、miR424、miR378、let-7α、let-7e這7種促血管新生miRNAs。結論:1.缺血下肢內局部移植iMSC-Exo能夠減輕缺血下肢的損傷,促進缺血下肢的功能恢復;尾靜脈移植iMSC-Exo能夠減輕缺血腦組織的損傷并促進缺血腦組織的功能恢復。2.局部移植iMSC-Exo能夠促進缺血下肢肌肉內的血管新生;尾靜脈移植iMSC-Exo能夠促進缺血腦組織內的血管新生。3.iMSC-Exo干預能夠促進體外培養(yǎng)的HUVECs的遷移、增殖及成管,并能夠促進HUVECs內血管新生相關基因的表達及蛋白的分泌。4.iMSC-Exo內高豐度表達多種血管新生相關性miRNAs,這些miRNAs可能參與iMSC-Exo的促血管新生功能。本研究結果表明,iMSC-Exo主要通過促進血管新生,提高缺血組織內的血流灌注,從而減輕缺血性組織損傷,并促進損傷組織的功能恢復。提示iMSC-Exo移植有望成為一種替代干細胞治療缺血性組織損傷的新策略。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R457.7

【參考文獻】

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1 曾淑紅;易成剛;郭樹忠;;局部miR-126基因治療促進小鼠缺血后肢血管新生的觀察[J];中國美容醫(yī)學;2012年13期

2 羅衡桂,楊竹林,丁應文,李永國,馬鐵祥,王力,王云;胰腺癌中三種血管生長因子受體的表達研究[J];中華消化雜志;2002年08期

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本文編號：2532360