發(fā)布時(shí)間：2019-08-02 19:00

【摘要】：基因治療的本質(zhì)是用基因載體攜帶目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞,通過遺傳學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)以糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常引起的疾病,從而達(dá)到治療各種疾病的目的。基因治療作為一種新的治療手段,可以治療包括癌癥、心血管疾病和遺傳性疾病等多種疾病,目前的研究主要集中于腫瘤的治療。尋找安全高效的基因載體是基因治療的關(guān)鍵之一。基因載體分為病毒型基因載體和非病毒型基因載體兩大類。非病毒載體通過理化方法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移,具有無傳染性、化學(xué)結(jié)構(gòu)可控、不限制載體容量及容易于大量制備等特點(diǎn)。與病毒載體相比,它還具有低毒性、低免疫性、所攜帶的目的基因不會(huì)整合至宿主細(xì)胞基因組等優(yōu)勢。因此,非病毒載體領(lǐng)域近年來被廣泛研究。聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)因其“質(zhì)子海綿作用”而成為研究最廣泛的一種聚陽離子非病毒基因載體。然而PEI在應(yīng)用中存在三個(gè)突出問題:第一,聚合物的轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性不一致:即高分子量PEI轉(zhuǎn)染效率高,細(xì)胞毒性大;而細(xì)胞毒性小的低分子量PEI,轉(zhuǎn)染效率低。第二,體液穩(wěn)定性與穿膜能力不一致:為了增加PEI體液穩(wěn)定性而增加聚合物的親水性,會(huì)導(dǎo)致PEI的穿膜能力降低,從而不利于目的基因的遞送。第三,PEI的細(xì)胞靶向性差:PEI通過靜電相互作用與細(xì)胞結(jié)合,因此無法識別特定細(xì)胞,靶向性欠缺。普朗尼克(Pluronic)是聚氧乙烯—聚氧丙烯—聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)組成的三嵌段共聚物。具有無毒、無刺激、無免疫原性、可溶于體液等優(yōu)點(diǎn),是制備聚合物膠束的常用材料之一。普朗尼克內(nèi)部的PEO鏈與PPO鏈的比例可調(diào),隨著PEO鏈比例增高,該化合物疏水性越弱,反之,則疏水性越強(qiáng)。普朗尼克在水溶液中自發(fā)形成多分子膠束,所形成的膠束尺寸和病毒相仿,適合在體內(nèi)傳輸。整合素是細(xì)胞表面受體的主要家族,是一種介導(dǎo)細(xì)胞和其外環(huán)境之間的跨膜受體。整合素是由α和β兩個(gè)亞單位形成的異二聚體,由它們相互組合形成的整合素有20余種。其中,整合素αvβ3高效表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中,而在普通細(xì)胞中罕有表達(dá),因此,整合素αvβ3已成為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽鏈,能以一定的親和力結(jié)合整合素αvβ3,為腫瘤治療的靶向性提供了新的策略。細(xì)胞穿膜肽可以在不損壞細(xì)胞膜的情況下穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞核。同時(shí),它還可以介導(dǎo)DNA、多胺類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。TAT(transactivator,Tat)是編碼HIV復(fù)制和基因表達(dá)所必須的反式激活蛋白,是常見的三種細(xì)胞穿膜肽之一。TAT中49-57位氨基酸殘基arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg(RKKRRQRRR)組成的線性序列可以完全行使細(xì)胞穿膜功能,這是TAT肽既有穿膜特性又無細(xì)胞毒性的最小片段。大分子物質(zhì)通過核孔復(fù)合物在細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)主動(dòng)耗能的過程,直徑小于9 nm的分子或分子量小于60k Da的蛋白質(zhì)可被動(dòng)彌散通過核孔復(fù)合物中間通道。非病毒載體轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA,從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)效率較低,是一個(gè)限速過程。核定位信號肽NLS富含堿基,結(jié)合DNA形成的DNA-NLS復(fù)合物,在細(xì)胞質(zhì)中可被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識別,與蛋白質(zhì)結(jié)合后將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)入核。這一特點(diǎn)對復(fù)合物克服細(xì)胞核膜屏障、提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要。擬設(shè)計(jì)三種多肽:(1)特異性親和整合素αvβ3的RGD(R4);(2)特異性親和整合素αvβ3的RGD肽與核定位信號肽NLS連接形成的雙功能肽RGD-NLS(R11);(3)特異性親和整合素αvβ3的RGD肽與細(xì)胞穿膜肽TAT、核定位信號肽NLS連接形成的三功能肽RGD-TAT-NLS(R18)。通過與PEI衍生物的連接,考察其作為基因載體修飾物對基因轉(zhuǎn)染的貢獻(xiàn)。其中,多肽可通過半胱氨酸(Cys)的巰基與PEI的氨基以SMCC為交聯(lián)劑連接,因此多肽設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)含有半胱氨酸(Cys)。三種功能肽在復(fù)合物入胞過程中起著不同的作用,將這三種肽以RGD為基礎(chǔ)組合成三種不同的多肽,分別與聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián),形成三種不同的基因載體。通過比較其理化性質(zhì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果,來評價(jià)三種不同多肽在基因載體應(yīng)用中的作用。我們對普朗尼克P123進(jìn)行活化,以其交聯(lián)低分子量PEI(PEI2KDa),得到高分子量聚乙烯亞胺衍生物P123-PEI。同時(shí)分別合成三種多肽R4、R11、R18,將三種多肽分別與PEI衍生物P123-PEI連接,形成三種新型轉(zhuǎn)基因載體P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18。同時(shí),比較包括細(xì)胞毒性在內(nèi)的聚合物理化性質(zhì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果,評價(jià)三種不同多肽在基因載體應(yīng)用中的作用。本文第一章主要介紹了聚乙烯亞胺PEI、普朗尼克及功能肽在基因載體中的應(yīng)用。包括聚乙烯亞胺的特性、普朗尼克P123作為基因載體修飾材料的優(yōu)勢以及各種功能肽在基因載體應(yīng)用中的研究成果等。本文第二章為三種基因載體P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的合成和表征。采用固相法制取功能肽,用質(zhì)譜測定多肽序列,HPLC測定相對含量。三光氣和琥珀酰亞胺法活化P123后與PEI 2000連接形成P123-PEI高分子量的聚合物。最后通過SMCC分別將R4、R11、R18與P123-PEI偶聯(lián)得到最終產(chǎn)物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18,用1H-NMR表征聚合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,成功合成了功能肽R4、R11、R18,其純度都在95%以上。通過1H-NMR分析,用SMCC法成功的將R4、R11、R18分別與P123-PEI偶聯(lián)形成最終產(chǎn)物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18。本文第三章考察了三種聚合物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的理化性質(zhì)。將三種聚合物分別與DNA混合后靜置,通過靜電吸附作用形成一定質(zhì)量比的復(fù)合物。通過酸堿滴定的方式考察三種復(fù)合物的緩沖能力,使用粒度—電位儀測定復(fù)合物的粒徑及Zeta電位,采用掃描電鏡觀察復(fù)合物的表面結(jié)構(gòu),通過凝膠電泳考察各復(fù)合物包裹DNA的能力及其對DNA的保護(hù)能力,最后采用MTT法考察三種聚合物的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明,三種聚合物的緩沖能力均明顯好于純水;復(fù)合物呈類球形結(jié)構(gòu),粒徑和電位適中;P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18與DNA質(zhì)量比分別為3.0、0.4和2.0時(shí)可以將DNA完全包裹,此外,三種聚合物都可以保護(hù)DNA抵抗較高濃度的Dnase I及血清的解離。與高分子量PEI(PEI 25 KDa)相比,P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18的細(xì)胞活性顯著提高。本文第四章考察了三種復(fù)合物P123-PEI-R4/DNA、P123-PEI-R11/DNA、P123-PEI-R18/DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力。分別以綠色熒光蛋白質(zhì)粒(p EGFP-N2)和蟲熒光素酶質(zhì)粒(p GL3-Control)為報(bào)告基因,考察三種復(fù)合物在B16細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況。分別通過熒光倒置顯微鏡和生物化學(xué)發(fā)光儀來評價(jià)綠色熒光蛋白質(zhì)粒和熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的表達(dá)情況。結(jié)果表明,三種復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率都明顯高于不連接多肽的聚合物P123-PEI。通過三種新合成的聚合物與先前課題組成功合成的基因載體P123-PEI-R13相互比較,得出聚合物P123-PEI-R11的轉(zhuǎn)染效果是最好的;修飾基因載體的多肽種類不宜過多,過多反而影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率;在修飾的多肽種類適宜的情況下,核信號定位肽NLS能顯著提高入核的效率。本課題合成了三種的新型的基因載體P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18,并通過綜合比較得出它們都具有低毒性、高轉(zhuǎn)染率的特性,適宜作為基因載體的備選材料。尤其是聚合物P123-PEI-R11,在各個(gè)方面性能評價(jià)都很突出,尤其是轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他聚合物數(shù)十倍,最適合作為基因載體。在修飾的多肽種類適宜的情況下,核信號定位肽NLS是提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。
【圖文】：

圖 2-2. R4 的質(zhì)譜圖Fig.2-2 Mass spectrometry of R425'.401'8.626'120180240300360420480540mV

R11的質(zhì)譜圖
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R450;O632.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2522307