發(fā)布時(shí)間：2019-04-26 09:11

【摘要】：內(nèi)毒素血癥是臨床常見(jiàn)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、胃腸道黏膜缺血壞死、機(jī)體免疫力下降,甚至機(jī)械通氣均有可能導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。而在圍手術(shù)期,內(nèi)毒素血癥更是常見(jiàn)。如果不能及時(shí)很好地處理和治療,發(fā)展成嚴(yán)重膿毒癥,導(dǎo)致膿毒性休克、急性心功能衰竭、急性肺損傷、急性腎損傷甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),最后多器官衰竭(multiple organ failure,MOF)的一系列失控性炎癥反應(yīng),常常是重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit,ICU)導(dǎo)致病人死亡的主要原因。研究?jī)?nèi)毒素血癥和膿毒癥的發(fā)病機(jī)理,尋求合適的治療方法仍然是目前衛(wèi)生事業(yè)工作者最關(guān)注的問(wèn)題之一。高遷移率族蛋白 B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)是目前被認(rèn)為在膿毒癥中最重要的"晚期"炎癥因子,其外周血表達(dá)水平對(duì)膿毒癥的預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。內(nèi)毒素血癥主要的致病因素內(nèi)毒素也稱脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),能通過(guò)結(jié)合模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)如Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)生成多種細(xì)胞炎癥因子,如腫瘤壞死因子 alpha(tumor necrosis factor alpha,TNF-a)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、IL-8等,也可以趨化細(xì)胞核中的HMGB1分泌到細(xì)胞外。胞外的HMGB1能通過(guò)結(jié)合糖化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product,RAGE)、TLR2 和 TLR4 等 PRR 受體激活 MAPK、PI3K/Akt、NFκB信號(hào)通路,進(jìn)一步促進(jìn)受損細(xì)胞生成炎癥因子,形成炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。當(dāng)機(jī)體缺血、缺氧、創(chuàng)傷時(shí),壞死的細(xì)胞也能直接釋放HMGB1,導(dǎo)致非細(xì)菌性SIRS。關(guān)于HMGB1在炎癥反應(yīng)中的作用已成熱點(diǎn)之一。而近年來(lái),表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)參與炎癥反應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)控作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)并受到重視。EGFR是人表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER)家族成員之一。HER 家族共有四個(gè)成員,除了 EGFR還有HER2、HER3、HER4,這些受體具有酪氨酸激酶活性。目前發(fā)現(xiàn)LPS結(jié)合TLR4能夠促進(jìn)一種金屬轉(zhuǎn)化酶腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme,TACE)釋放,TACE 進(jìn)一步裂解轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(transforming growth factor-alpha,TGF-α)游離釋放。TGF-α是 EGFR的配體,與EGFR結(jié)合后,EGFR能與自身或家族成員形成二聚體并導(dǎo)致自身磷酸化參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。HER2目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的配體,被認(rèn)為是一種孤受體。EGFR主要與HER2形成異型二聚體,研究發(fā)現(xiàn)相比同型二聚體,這種結(jié)合在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中效率更高。EGFR的磷酸化能激活下游的MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路,最終激活NFκB轉(zhuǎn)錄因子或者SP1(specifcity protein-1)轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)IL-8、IL-1等炎癥因子釋放�？梢钥闯�,HMGB1與EGFR在參與炎癥反應(yīng)具有共通性。兩者都能通過(guò)TLR信號(hào)通路激活下游的MAPK、PI3K/Akt、NFκB等信號(hào)通路。但是EGFR的激活是否介導(dǎo)TNF-α的生成釋放,目前沒(méi)有明確結(jié)論。而且對(duì)于HMGB1導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)的研究中,EGFR是否參與其炎癥反應(yīng)機(jī)制,目前幾乎沒(méi)有相關(guān)的研究工作。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦邪l(fā)現(xiàn),使用EGFR抑制劑PD168393和厄洛替尼(Erlotinib)能明顯減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的TNF-α的釋放。證實(shí)了 EGFR確實(shí)參與炎癥反應(yīng)中TNF-α的生成。同樣對(duì)多種細(xì)胞使用EGFR抑制劑預(yù)處理,能明顯減少HMGB1刺激后TNF-α的生成。這為我們本研究提供充分的依據(jù)。本研究采用兩種EGFR抑制劑PD168393和Erlotinib,對(duì)體外培養(yǎng)的THP1細(xì)胞和原代小鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage,BMM)進(jìn)行兩方面的研究:1、探討表皮生長(zhǎng)因子受體是否參與HMGB1誘導(dǎo)的TNF-a的生成;2、探討表皮生長(zhǎng)因子受體可能參與HMGB1誘導(dǎo)TNF-α生成的機(jī)制。材料與方法1.細(xì)胞毒性及活力試驗(yàn):CCK-8(cell counting kit-8)法測(cè)定不同濃度EGFR抑制劑PD168393和Erlotinib的細(xì)胞毒性,選擇合適的濃度給藥;同樣用CCK-8法檢測(cè)HMGB1給藥后24小時(shí)和48小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的活力。2.實(shí)驗(yàn)分組:將培養(yǎng)后的THP1細(xì)胞或者BMM細(xì)胞給予抑制劑預(yù)處理時(shí)分為 6 個(gè)組:對(duì)照組(Ctrl),Erlotinib 組(Er,20μM),PD168393 組(PD,10μM),HMGB1 組(HI,1μg/ml),HMGB1+Erlotinib 組(H1+Er)和 HMGB1+PD168393組(H1+PD),使用抑制劑預(yù)處理30min后再使用HMGB1刺激4h,另外預(yù)實(shí)驗(yàn)中增加一組HMGB1煮沸后給藥組,排除HMGB1中可能的LPS干擾。3.siRNA轉(zhuǎn)染沉默EGFR和HER2:PD168393是一種不可逆選擇性抑制劑,既可以抑制HER2受體,也可以抑制EGFR受體。為了明確HMGB1導(dǎo)致TNF-a的生成是由EGFR參與還是兩者皆有參與,我們對(duì)細(xì)胞siRNA沉默EGFR和HER2的mRNA表達(dá)后再進(jìn)行HMGB1刺激。實(shí)驗(yàn)分為6組:空白對(duì)照組(Ctrl)、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(Lipo2000)、陰性對(duì)照組(NC)、HMGB1組、HMGB1+si-EGFR組、HMGB1+ si-HER2組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后使用HMGB1刺激4h。4.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-a的表達(dá):收集上清,使用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測(cè) TNF-a 表達(dá)水平。5.PCR法檢測(cè)細(xì)胞中EGFR和HER2的mRNA表達(dá):細(xì)胞提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase Chain Reaction,Q-PCR)檢測(cè) EGFR 和 HER2 mRNA 的表達(dá)情況。6.western blot檢測(cè)細(xì)胞磷酸化蛋白EGFR、ERK1/2和P38表達(dá):給藥4小時(shí)后,收集細(xì)胞并使用磷酸鹽緩沖液清洗2遍,使用western blot法檢測(cè)細(xì)胞磷酸化蛋白EGFR、ERK1/2和P38表達(dá)。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。不同時(shí)間點(diǎn)采用重復(fù)測(cè)量方差分析;兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組比較采用單因素方差分析(one wayANVOA),組間比較有顯著差異時(shí),方差齊用LSDt檢驗(yàn),方差不齊用Dunnett'st檢驗(yàn)。P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作圖使用GraphPad Prism 5.0作圖軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.HMGB1刺激THP1細(xì)胞磷酸化EGFR蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為control組和HMGB1組。HMGB1組給予1μg/mlHMGB1刺激1小時(shí),control組給予等體積生理鹽水對(duì)照。western blot檢測(cè)細(xì)胞磷酸化EGFR的表達(dá),與control組相比,HMGB1組磷酸化EGFR表達(dá)明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明HMGB1刺激后能轉(zhuǎn)激活THP1細(xì)胞中的EGFR,導(dǎo)致EGFR磷酸化。2.不同濃度PD168393和Erlotinib的細(xì)胞毒性比較在THP1細(xì)胞中,PD168393最高濃度組(20μM)與對(duì)照組以及其他濃度組相比,細(xì)胞活力明顯下降(P0.05);Erlotinib50μM組和100μM組兩個(gè)濃度組對(duì)照組以及其他低濃度組相比,細(xì)胞活力下降且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P0.05、P0.01)。根據(jù)結(jié)果我們選取 PD168393 10μM 和 Erlotinib 20μM 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.HMGB1給藥對(duì)細(xì)胞活力的影響THP1細(xì)胞分別經(jīng)EGFR抑制劑Erlotinib和PD168393預(yù)處理30min后,給予1μg/ml HMGB1刺激繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。CCK-8結(jié)果顯示24小時(shí)和48小時(shí)兩個(gè)水平細(xì)胞活力差異有顯著意義(P0.001),分組與時(shí)間有交互作用(P0.001)。HMGB1刺激隨著時(shí)間延長(zhǎng),增殖能力提高(P0.05)。同一時(shí)間組間比較,與對(duì)照組相比,HMGB1組細(xì)胞增殖能力在24小時(shí)和48小時(shí)均顯著提高(P0.01);與HMGB1組相比較,HMGB1+Erlotinib組在24小時(shí)和48小時(shí)細(xì)胞活力下降均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),HMGB1 +PD168393組24小時(shí)細(xì)胞活力無(wú)顯著差異(P0.05),而48小時(shí)有顯著差異(P0.01)。4.EGFR抑制劑對(duì)HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)水平影響在THP1細(xì)胞刺激4小時(shí)后,對(duì)照組TNF-α表達(dá)水平為14.85±8.52pg/ml,HMGB1 組 TNF-α釋放顯著增加為 4192.93±688.41 pg/ml(P0.01)。兩種 EGFR抑制劑預(yù)處理后均能抑制部分TNF-α的釋放(P0.01),使TNF-α濃度水平分別降至 474.78±25.43pg/ml(Erlotinib)、1333.48±105.85pg/ml(PD 168393);PD168393抑制HMGB1刺激TNF-α的生成,效果比使用Erlotinib好(P0.01)。與HMGB1組比較,HMGB1煮沸后給藥TNF-α的表達(dá)明顯較低(177.96±14.50pg/ml,P0.01),說(shuō)明HMGB1導(dǎo)致的TNF-α的生成主要是由于HMGB1本身導(dǎo)致的,并不是由于HMGB1混有LPS導(dǎo)致的。在BMM細(xì)胞中,得到的結(jié)果與THP1細(xì)胞相似。細(xì)胞經(jīng)HMGB1刺激后,TNF-α水平從14.14±4.21pg/ml上升到1728.41±265.35pg/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。使用抑制劑能減少TNF-α生成約50%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而兩種抑制劑抑制效能無(wú)顯著差異(P0.05)。5.siRNA對(duì)HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)水平的影響THP1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EGFR和HER2的siRNA后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到50%-60%為轉(zhuǎn)染成功。給予HMGB1刺激4小時(shí),檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與control組相比,HMGB1組、HMGB1+si-EGFR組和HMGB1+si-HER2組TNF-α表達(dá)增高,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。相比HMGB1 組,HMGB1+si-EGFR 組和 HMGB1+si-HER2 組沉默 EGFR 或 HER2 mRNA表達(dá)后,部分TNF-α釋放能被抑制,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HMGB1+si-EGFR組和HMGB1+si-HER2組抑制TNF-α生成的水平相當(dāng),無(wú)顯著性差異(P=0.307)。6.HMGB1對(duì)ERK1/2和P38磷酸化的影響western blot檢測(cè)細(xì)胞給藥后磷酸化蛋白ERK1/2和P38。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,HMGB1刺激細(xì)胞后4小時(shí),ERK1/2和P38的磷酸化水平明顯提高(P0.01)。與 HMGB1 給藥組相比,HMGB1+Erlotinib 和 HMGB1+PD168393兩組ERK1/2的磷酸化水平能明顯被抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),其中HMGB1+PD168393組比HMGB1+Erlotinib組ERK1/2磷酸化水平抑制更明顯(P0.01);與HMGB1給藥組相比,HMGB1+PD168393組磷酸化P38表達(dá)水平有顯著性差異(P0.01),而HMGB1+Erlotinib組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.194)。HMGB1+PD168393組相比HMGB1+Erlotinib組,磷酸化P38表達(dá)水平降低明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、HMGB1能誘導(dǎo)THP1細(xì)胞、原代小鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞TNF-α的生成。2、表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和HER2均參與HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α生成。3、HMGB1誘導(dǎo)細(xì)胞TNF-α生成,其可能機(jī)制是通過(guò)激活EGFR和HER2,進(jìn)一步激活MAPK信號(hào)途徑的ERK1/2和P38,導(dǎo)致ERK1/2和P38的磷酸化,調(diào)節(jié)TNF-α的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)TNF-α生成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R459.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 丁寧;肖慧;高巨;許立新;佘守章;;HMGB1啟動(dòng)子紅色熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建及在機(jī)械牽張誘導(dǎo)下的活性檢測(cè)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年22期

2 Baoping Chang;Xiao Wang;Songsou Gao;Bianfeng Zhao;Wanli Wang;Shaohua Yang;Qian Chu;Shiying Yu;;乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中HMGB1表達(dá)的臨床意義(英文)[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2014年05期

3 唐小蘭;郗愛(ài)旗;;HMGB1與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展[J];西南軍醫(yī);2013年05期

4 丁寧;肖慧;高巨;許立新;佘守章;;HMGB1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建及鑒定[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年22期

5 賀小燕;王海琳;陳曉紅;陳丑彥;;HMGB1在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年04期

6 易世紅;孫陸果;魏成國(guó);黃紅蘭;;脂多糖刺激對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2009年08期

7 歐陽(yáng)華偉;譚軍;李高峰;羅成群;;小鼠HMGB1突變型啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年08期

8 欒正剛;郭仁宣;;HMGB1對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J];中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2013年01期

9 張巧玲;任少敏;;HMGB1細(xì)胞因子作用研究進(jìn)展[J];疾病監(jiān)測(cè)與控制;2013年05期

10 肖建彪;陳龍華;陳斌;;HMGB1在多種人體惡性腫瘤組織、癌旁組織中的表達(dá)及意義[J];山東醫(yī)藥;2013年12期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 葉惠惠;張?jiān)伱?劉河霞;張嬌麗;吳克儉;;HMGB1協(xié)同Toll樣受體4/MyD88/NF-κB參與小鼠酒精性胃黏膜損傷過(guò)程[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)消化內(nèi)分泌生殖代謝生理專業(yè)委員會(huì)2011年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2011年

2 張曉娟;欒正剛;馬曉春;;構(gòu)建HMGB1基因真核細(xì)胞表達(dá)載體[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)重癥醫(yī)學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2011年

3 孟二紅;郭子寬;吳祖澤;王立生;;HMGB1對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[A];第11次中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文匯編[C];2007年

4 張旭芳;蔣宏偉;凌均h，

本文編號(hào)：2465946