【摘要】：目的:宮頸癌輻射抵抗與腫瘤細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins,IAP)的表達(dá)相關(guān),本研究旨在觀察小分子IAP抑制劑AT-406對常、乏氧宮頸癌細(xì)胞的輻射增敏效應(yīng),探討給藥濃度及時(shí)序?qū)椛湓雒糇饔玫挠绊?闡明AT-406放射增敏及改善乏氧微環(huán)境可能的機(jī)制。方法:(1)CCK-8法檢測AT-406單獨(dú)給藥時(shí)對人類宮頸癌細(xì)胞株Hela和Siha的細(xì)胞增殖抑制作用,繪制出細(xì)胞抑制率曲線,計(jì)算AT-406對腫瘤細(xì)胞作用的IC50值。(2)克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察不同藥物濃度的AT-406對常氧和乏氧Hela和Siha細(xì)胞的放療增敏作用,比較單純照射以及藥物與輻射聯(lián)合后細(xì)胞的成瘤能力,觀察對AT-406宮頸癌放射增敏性的影響。(3)在常氧和乏氧微環(huán)境中,采用流式細(xì)胞法檢測不同濃度AT-406單純給藥、單純輻照(8 Gy)以及AT-406+輻照聯(lián)合作用后Hela和Siha的細(xì)胞凋亡率情況。(4)常氧和乏氧條件下利用細(xì)胞免疫熒光染色動(dòng)態(tài)觀察AT-406對不同劑量的輻射引起宮頸癌細(xì)胞DNA雙鍵斷裂的影響。(5)免疫印跡分析(Western Blotting)檢測AT-406按藥物濃度梯度給藥后Hela和Siha細(xì)胞中IAP家庭相關(guān)蛋白(c IAP1、c IAP2及XIAP)的變化,并研究蛋白表達(dá)量與給藥時(shí)間的關(guān)系;同時(shí)通過檢測凋亡及乏氧相關(guān)通路蛋白探討AT-406對宮頸癌細(xì)胞乏氧增敏可能的機(jī)制。(6)Caspase-3,-8,-9活性測定明確AT-406單純給藥、單純輻照(8 Gy)以及AT-406+輻照聯(lián)合作用對Hela和Siha細(xì)胞凋亡通路的影響。結(jié)果:(1)不同濃度的AT-406對Hela和Siha細(xì)胞均呈量效性和時(shí)效性的生長抑制作用,24 h AT-406對Hela和Siha細(xì)胞的IC50值分別為83.32和64.26μM。(2)考慮臨床常規(guī)放療劑量的實(shí)用性及參考文獻(xiàn)資料,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取8 Gy為放療劑量,AT-406選取IC20的高、低兩個(gè)藥物濃度(5和10μM)進(jìn)行比較,聯(lián)合治療中采用先藥后放作用時(shí)序。(3)克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),常氧條件下單純輻射與射線聯(lián)合AT-406作用均能抑制兩種宮頸癌細(xì)胞集落形成,聯(lián)合組抑制作用更加明顯,但AT-406對Siha細(xì)胞的抑制效應(yīng)依賴更高的藥物濃度,10μM AT-406聯(lián)合放療時(shí)Hela和Siha細(xì)胞的SER分別為1.81和1.43(P0.05);而乏氧條件下,AT-406仍能促進(jìn)輻照對兩種宮頸癌細(xì)胞集落形成的抑制作用,且較常氧時(shí)更加明顯,AT-406高藥+輻照組Hela和Siha細(xì)胞的SER分別為2.07和1.72,P0.05。(4)流式細(xì)胞檢測對照組、AT-406單純給藥組、單純照射組及AT-406+照射聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率,單獨(dú)放射與AT-406聯(lián)合射線作用均能引發(fā)兩種宮頸癌細(xì)胞凋亡,聯(lián)合組促凋亡作用更加明顯,且具有時(shí)間、濃度依賴性,AT-406對Siha細(xì)胞的放療增敏作用在乏氧微環(huán)境下更加明顯。(5)免疫熒光染色證實(shí)AT-406處理后的宮頸癌細(xì)胞更易因X射線造成DNA雙鏈斷裂,且自我修復(fù)能力降低。(6)Western Blotting法檢測AT-406不同藥物濃度作用下宮頸癌細(xì)胞IAP家族蛋白表達(dá)情況,結(jié)果表明AT-406在常氧條件下可以使Hela細(xì)胞中cIAP1蛋白的表達(dá)降低,乏氧時(shí)可同時(shí)下調(diào)cIAP1和XIAP蛋白,而對于Siha細(xì)胞AT-406僅能在乏氧時(shí)降低XIAP的表達(dá),在給藥后12-24 h內(nèi)AT-406對IAP家族蛋白的抑制作用最為明顯;結(jié)合對乏氧相關(guān)通路蛋白的檢測,AT-406在乏氧宮頸癌細(xì)胞中的作用可能與STAT3磷酸化的抑制有關(guān)。(7)Caspase活性檢測表明AT-406的促凋亡作用同時(shí)依賴外源性和內(nèi)源性兩條凋亡通路。結(jié)論:(1)AT-406具有明顯的放射增敏作用,能增強(qiáng)X射線對Hela和Siha細(xì)胞增殖的抑制作用,且增敏作用存在藥物濃度依賴性。(2)AT-406對乏氧的宮頸癌細(xì)胞同樣具有較強(qiáng)的放射增敏作用。(3)AT-406的放療增敏作用可能同時(shí)依賴于對IAP家族蛋白表達(dá)和STAT3磷酸化的抑制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33;R730.55

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本文編號：2451756