【摘要】：喹諾酮類藥物是目前應(yīng)用非常廣泛的廣譜抗生素之一,細(xì)菌對(duì)該類藥物的耐藥性備受關(guān)注。介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥的機(jī)制包括染色體基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥。其中,qnr基因是近年來的研究熱點(diǎn),qnr基因型包括qnr A、qnr B、qnr C、qnr S,本地區(qū)以qnr B型多見。qnr B存在于ISCR1(Insertion Sequence Common Regions 1,插入序列共同區(qū)1)可變區(qū)內(nèi),與ISCR1相連介導(dǎo)耐藥傳播。而ISCR1通常與I類整合子結(jié)合,組成復(fù)合性I類整合子。由于同時(shí)含有I類整合子和ISCR1兩種基因轉(zhuǎn)移元件,因此,復(fù)合性I類整合子具有對(duì)耐藥基因更強(qiáng)大的傳播能力。對(duì)整合子、qnr基因等的檢測(cè),以往的方法主要有:PCR-RFLP、脈沖凝膠電泳技術(shù)、Southern Blot技術(shù)等,這些方法繁瑣,耗時(shí)耗力,因此建立一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)Int I-ISCR1-qnr B的方法十分必要。鑒于此,本研究通過調(diào)查研究199例臨床分離株,首先建立一種可快速檢測(cè)I類整合子、ISCR1和喹諾酮耐藥基因qnr B的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法,并對(duì)該方法的特異性和靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上,利用所建立的Int I-ISCR1-qnr B方法檢測(cè)臨床分離株,通過與藥敏試驗(yàn)方法比較,分析方法的臨床應(yīng)用價(jià)值,為喹諾酮類耐藥提供臨床預(yù)警信息。方法1.菌株來源:199例革蘭陰性桿菌菌株分離自2014年11月9日至2014年5月5日期間某院臨床各科室送檢標(biāo)本。2.微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)對(duì)所有臨床分離株進(jìn)行鑒定和藥敏分析。3.采用Primer Premier5.0軟件,以I類整合酶基因、ISCR1保守區(qū)orf513、qnr B基因保守區(qū)為靶區(qū)分別設(shè)計(jì)特異性的引物,構(gòu)建Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法反應(yīng)體系。4.梯度PCR法確定Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法的最適退火溫度。5.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)I類整合子、ISCR1、qnr B耐藥基因,瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,以Image J軟件掃描電泳條帶灰度值,對(duì)目的基因進(jìn)行半定量分析。6.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法檢測(cè)80例臨床分離菌株,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,評(píng)價(jià)建立的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法的特異性。7.麥?zhǔn)媳葷岱z測(cè)細(xì)菌濃度,將細(xì)菌原始濃度稀釋成108cfu/ml,并依次倍比稀釋為107、106、105、104、103、102、101cfu/ml,用Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,分析該方法的靈敏度。8.以Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法檢測(cè)119例臨床分離株,并與藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較。9.采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩種方法之間的差異比較用?2檢驗(yàn),α=0.05。結(jié)果1.梯度PCR法確定Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法的最適退火溫度為57.5℃。2.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)到I類整合子、ISCR1、qnr B三個(gè)基因,產(chǎn)物分別是280bp、475bp、607bp,與目標(biāo)靶序列一致。3.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法檢測(cè)80例臨床分離菌株,Int I-ISCR1-qnr B陽性19例,平均OD值分別為Int I 217.9±33.3,ISCR1 243.2±60.6,qnr B203.7±59.4.Int I-ISCR1-qnr B陰性61例。測(cè)序分析Int I-ISCR1-qnr B陽性的為19例,符合率100%,測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast證實(shí)與Gene Bank公布序列一致,序列號(hào)分別是:HQ018645.1,KM111273.1,NG036203.1。4.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法靈敏度為101cfu/ml。5.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法檢測(cè)119例臨床分離菌株Int I-ISCR1-qnr B基因,Int I-ISCR1-qnr B陽性35例,Int I-ISCR1-qnr B陰性84例。藥敏試驗(yàn)喹諾酮耐藥92例,敏感及中介27例。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)?2=3.36?2(0.05,1)=3.84,P0.05,所建立的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法與藥敏試驗(yàn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.成功建立了能夠一次PCR同時(shí)檢測(cè)I類整合子、ISCR1、qnr B耐藥基因三個(gè)靶標(biāo)的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法,該方法靈敏、快速、特異性強(qiáng)。2.所建立的Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法檢測(cè)qnr B基因與藥敏檢測(cè)結(jié)果相符合。3.Int I-ISCR1-qnr B多重PCR方法檢測(cè)Int I-ISCR1-qnr B基因可為臨床喹諾酮耐藥提供預(yù)警信息。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R440

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2441342