【摘要】：目的：研究核受體SHP (small heterodimer partner)在BMP9 (bone morphogenetic protein 9)所誘導的間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化中的作用。方法：首先我們構建并鑒定了過表達SHP (Ad-SHP)及沉默SHP(Ad-siSHP)的重組腺病毒。通過RT-PCR及Western Blot檢測外源性BMP9對MSCs細胞中SHP表達的影響；然后利用腺病毒Ad-SHP或Ad-siSHP感染細胞,并加以BMP9刺激,通過定量及染色分析其對BMP9誘導的MSCs成骨分化早期指標堿性磷酸酶(Alkaline phosphotase, ALP)的影響；茜素紅染色分析成骨晚期指標鈣鹽沉積的變化；RT-PCR檢測成骨晚期指標OCN (Osteocalcin)和OPN(Osteopontin)的變化。接著,通過RT-PCR檢測SHP對BMP9所誘導的成骨標志基因Runx2、Id家族和CTGF的影響;Western blot檢測SHP對BMP9誘導的Runx2和D1x5蛋白表達的影響；熒光素酶報告基因實驗和Western Blot檢測SHP對BMP9活化的經(jīng)典Smad信號通路的影響。結果：RT-PCR和Western Blot均顯示Ad-SHP及Ad-siSHP構建成功且有效,接著通過RT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)外源性BMP9可上調C3H10T1/2細胞和C2C12細胞中內源性SHP的表達；過表達SHP能夠促進BMP9所誘導的ALP活性的增加,同時促進了晚期成骨指標鈣鹽沉積以及OCN和OPN的表達,而沉默SHP后BMP9所誘導的早晚期成骨標志均受到了抑制。RT-PCR和Western Blot結果同樣顯示SHP促進了BMP9成骨關鍵轉錄因子Runx2、Dlx5及相關靶基因Idl、Id2、和CTGF的表達,而當SHP被干擾后,這些基因及蛋白的表達均受到抑制；BMP9本身能夠激活經(jīng)典Smad信號通路,但是SHP對于BMP9誘導的經(jīng)典信號通路的磷酸化并無明顯影響；值得注意的是,干擾SHP能夠抑制BMP9激活的SBE熒光素酶活性。結論：SHP可調控BMP9所誘導的間充質干細胞的成骨分化,很可能是通過促進BMP9誘導的Smad轉錄活性而實現(xiàn)。
[Abstract]:Aim: to investigate the role of nuclear receptor SHP (small heterodimer partner) in the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells, MSCs) induced by BMP9 (bone morphogenetic protein 9. Methods: first, we constructed and identified recombinant adenovirus expressing SHP (Ad-SHP) and silencing SHP (Ad-siSHP). The effects of exogenous BMP9 on the expression of SHP in MSCs cells were detected by RT-PCR and Western Blot. Then the cells were infected with adenovirus Ad-SHP or Ad-siSHP and stimulated by BMP9. The effects of adenovirus on BMP9-induced alkaline phosphatase (Alkaline phosphotase, ALP) in the early stage of osteogenic differentiation of MSCs were analyzed by quantitative analysis and staining. Alizarin red staining was used to analyze the changes of calcium salt deposition in the late osteogenic stage, and RT-PCR was used to detect the changes of OCN (Osteocalcin) and OPN (Osteopontin) in the late osteogenic stage. Then, the effect of SHP on Runx2,Id family and CTGF induced by BMP9 was detected by RT-PCR.; Western blot was used to detect the effect of SHP on Runx2 and D1x5 protein expression induced by BMP9. Luciferase reporter gene assay and Western Blot were used to detect the effect of SHP on the classical Smad signaling pathway activated by BMP9. Results: both RT-PCR and Western Blot showed that Ad-SHP and Ad-siSHP were constructed successfully and effectively. Then RT-PCR and Western Blot showed that exogenous BMP9 could up-regulate the expression of endogenous SHP in C3H10T1/2 cells and C2C12 cells. Overexpression of SHP could promote the increase of ALP activity induced by BMP9, calcium deposition and expression of OCN and OPN in late osteogenic markers. The results of RT-PCR and Western Blot also showed that SHP promoted the expression of Runx2,Dlx5, the key transcription factor of BMP9 osteogenesis, and the related target genes Idl,Id2, and CTGF, and when SHP was interfered with, the expression of osteogenic markers induced by BMP9 was inhibited by silencing SHP, and the expression of Runx2,Dlx5 and related target genes Idl,Id2, and CTGF were also enhanced by SHP. The expression of these genes and proteins were inhibited. BMP9 itself can activate the classical Smad signaling pathway, but SHP has no obvious effect on the phosphorylation of the classical signaling pathway induced by BMP9. It is worth noting that interference SHP can inhibit the activity of SBE luciferase activated by BMP9. Conclusion: SHP can regulate the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells induced by BMP9, which may be achieved by promoting the transcriptional activity of Smad induced by BMP9.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R440

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本文編號：2433889