【摘要】：研究背景：近年來由于抗菌藥物廣泛使用導(dǎo)致耐藥致病菌迅速增加,碳青酶烯類抗生素耐藥率也在逐漸增加。碳青酶烯類抗生素耐藥的主要機制有：細(xì)菌能產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶水解碳青酶烯類藥物,各種細(xì)菌胞膜對藥物的通透性降低以及細(xì)菌青霉素蛋白結(jié)合能力下降。碳青霉烯酶屬于一類能水解亞胺培南及美羅培南的β-內(nèi)酰胺酶,根據(jù)其Ambler分子結(jié)構(gòu)的不同分為A、B、D三類酶,而B類酶屬于金屬酶MBLs,金屬-β-內(nèi)酰胺酶又稱金屬酶,能水解大部分抗生素,可被金屬螯合劑抑制抑制。新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1[3](new nelhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)是碳青酶烯類酶的一種,其由基因blaNDM-1編碼,幾乎能水解所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素。全球首次于2008年報道了產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌(KP05-506)和大腸埃希菌(NF-NDM-1),當(dāng)時該兩株菌分別來自兩患者的尿液及糞便。隨后產(chǎn)NDM-1耐藥菌快速波擴散到全球各地,歐美許多國家相繼出現(xiàn)了關(guān)于NDM-1的報道。而印度因為最早出現(xiàn)產(chǎn)NDM-1細(xì)菌而且出現(xiàn)的病例最多,所以被認(rèn)為是NDM-1發(fā)源地。主要是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌等革蘭陰性菌能產(chǎn)NDM-1,其他細(xì)菌如產(chǎn)酸克雷伯桿菌、普羅威登斯菌等也有相應(yīng)報道。自上世紀(jì)90年代以來,已發(fā)現(xiàn)的有NDM-1、SIM-1、SPM-1、 GIM-1、TMB-1、DIM-1、IMP、KHM-1、SPM-1和AIM-1等金屬β-內(nèi)酰胺酶,主要分布于革蘭陰性菌中,各種耐藥基因可通過質(zhì)�；蛘献釉诓煌�(xì)菌間水平擴散。自2010年以來我國就報道了有屎腸球菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、臭鼻克雷伯菌等細(xì)菌能產(chǎn)NDM-1,而產(chǎn)NDM-1的陰溝腸桿菌未見報道。目前只有印度地區(qū)報道過產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌的病例。本實驗從我院一位住院患者中分離出國內(nèi)第一株產(chǎn)NDM-1的陰溝腸桿菌,該患者是一名67歲的女性于2012年2月13日入院,病因是連續(xù)18天咳嗽咳痰；此病人還有冠心病、Ⅱ型糖尿病等病史；入院查體：端坐呼吸,雙下肢輕度水腫,R 22次/分,雙肺呼吸音低,體溫36.2。C,氣促,P100次/分,BP 135/96mmHg。胸部CT：左肺及右肺中下葉炎癥。血常規(guī)：WBC 10.6×10~9/L, PCT 0.45 ng/ml, N 85.9%,。痰培養(yǎng)結(jié)果提示有陰溝腸桿菌生長�；颊呷朐汉�,我們首先使用頭孢唑肟鈉2 g bid對其抗感染治療,但持續(xù)兩天患者并沒有獲得明顯的治療效果；血常規(guī)復(fù)查：WBC10.6×109/L,N81.9%。后更改使用莫西沙星400 mg qd加強治療。病人接受此治療八天之后病情得到明顯緩解,血常規(guī)復(fù)查結(jié)果為WBC5.52×109/L,N 67.6%,；胸部CT：肺部的炎癥減輕,其中最明顯的是左下肺。因為病人情況好轉(zhuǎn),改用頭孢哌酮舒巴坦鈉3 g bid對其進(jìn)行降階治療,病人八天之后不再有咳嗽咳痰,血常規(guī)復(fù)查：5.53×109/L,N70.7%,患者痊愈出院。此病人于2012年5月4日再次入院,病因是尿毒癥、咳嗽、咳痰,但是血常規(guī)檢查結(jié)果正常,痰液中無細(xì)菌生長；而其尿液中培養(yǎng)出大腸埃希菌,沒有發(fā)現(xiàn)攜帶NDM-1基因,對碳青霉烯類敏感,也未在患者的尿液和糞便中檢測到產(chǎn)NDM-1的細(xì)菌。經(jīng)排查,該患者未曾到過印度或巴基斯坦等地旅游或工作。體外敏感試驗顯示：E. Cloacae 413對除外磷霉素與多粘菌素B幾乎所有抗生素耐藥。我們采用改良Hodge試驗及亞胺培南-EDTA Etest試紙條協(xié)同試驗證實分離出的陰溝腸桿菌產(chǎn)碳青酶烯類陽性,PCR可以從E. Cloacae413的DNA中擴增出blaNDM-1條帶,擴增產(chǎn)物測序確認(rèn)攜帶NDN-1基因。接合實驗證實blaNDM-1可以隨著質(zhì)粒在E. Cloacae 413與接合子E. coli J53 (PNDM-1)細(xì)菌間轉(zhuǎn)移,且該質(zhì)粒大小約為20kb,脈沖場凝膠電泳顯示此株陰溝腸桿菌為B型,Southern blotting結(jié)果還表明blaNDM-1存在于細(xì)菌染色體的250至300KB處。我們采用PCR法及BLAST比對法發(fā)現(xiàn)E. Cloacae 413同時還攜帶blaCTX-M-14, rmtA, qnrA, qnrB, aac6'-Ib-cr五種耐藥基因,這些耐藥基因也可通過結(jié)合試驗將耐藥性傳遞給受體菌,說明這些耐藥基因可能同時位于同-質(zhì)粒上。由于產(chǎn)NDM-1能導(dǎo)致細(xì)菌對幾乎所有碳青酶烯類抗生素耐藥,所以此株陰構(gòu)腸桿菌的出現(xiàn)可能會導(dǎo)致耐藥菌蔓延,對我們控制感染性疾病造成極大的影響,所以尋找此株產(chǎn)NDM-1的陰溝腸桿菌的來源及傳播途徑對我們控制細(xì)菌耐藥性是很關(guān)鍵的。本文將重點探討此株產(chǎn)NDM-1的陰溝腸桿菌的致病性及分析其基因序列特征。目的：分析產(chǎn)NDM-1的陰溝腸桿菌413的體外增殖能力、致病性、生物信息學(xué)分析以及耐藥機制,從而探討其耐藥基因的可能來源及控制其可能的傳播途徑。方法：第一部分：用MTT法測定產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌413與陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株4533的生長曲線并比較兩株細(xì)菌的體外增殖能力,用小鼠腹膜炎模型測定檢測產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌413與陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株4533的毒力并比較兩種菌株致病能力的大小。第二部分：對陰溝腸桿菌413進(jìn)行全基因組測序和序列分析,并與其他產(chǎn)NDM-1菌株攜帶NDM-1質(zhì)粒的序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對,分析耐藥基因的可能來源及陰溝腸桿菌413遺傳特征。結(jié)果：第一部分：同一濃度的陰溝腸桿菌413及陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株4533兩株細(xì)菌增殖能力是不同,菌株413的增殖能力要強于標(biāo)準(zhǔn)株4533。413菌株的完全致死量和完全不致死量分別為109和104,而4533菌株的分別為1010和105；數(shù)據(jù)表明,413菌株的完全致死所需劑量明顯小于4533菌株,而且完全不致死量的結(jié)果相似,413菌株的LD5o為4.27×107,4533菌株的LD5o為1.29×108。所以413菌株的的體外繁殖能力及毒力強于標(biāo)準(zhǔn)株4533。第二部分：本實驗對E. cloacae 413細(xì)菌進(jìn)行全基因組測序,明確了其基因輪廓；并構(gòu)建群體系統(tǒng)發(fā)育樹,陰溝腸桿菌413含NDM-1的質(zhì)粒與不動桿菌PM131含NDM-1質(zhì)粒、肺炎克雷伯菌PKP_STM29含NDM-1質(zhì)粒、大腸桿菌PEC STM17含NDM-1質(zhì)粒、陰溝腸桿菌菌株TP15含NDM-1質(zhì)粒有較高的同源性,這提示陰溝腸桿菌413含NDM-1的質(zhì)�？赡苁怯蛇@些細(xì)菌之間平行傳遞的。然而耐藥基因比對結(jié)果提示陰溝腸桿菌413含NDM-1的質(zhì)粒所含耐藥基因在不動桿菌PM131含NDM-1質(zhì)粒、肺炎克雷伯菌PKP_STM29含NDM-1質(zhì)粒、大腸桿菌PEC STM17含NDM-1質(zhì)粒、陰溝腸桿菌菌株TP15含NDM-1質(zhì)粒里均不存在,這提示可能NDM-1是通過基因片段的插入傳遞的,也有可能其他耐藥基因在質(zhì)粒傳遞過程中丟失或者藥物選擇作用出現(xiàn)了基因變異；最后解析了整個代謝通路和絕大部分基因的功能,從而發(fā)現(xiàn)產(chǎn)抗生素等次級代謝產(chǎn)物的整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和耐藥相關(guān)基因的分布,從而為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)并從基因組角度解釋細(xì)菌耐藥性、細(xì)菌與藥物相互作用、細(xì)菌與宿主相適應(yīng)性機制等提供新的思路。結(jié)論：產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌E. cloacae 413的繁殖能力及侵襲力均強于陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株4533。陰溝腸桿菌413全基因測序及序列比對結(jié)果提示NDM-1的可能來源是通過基因片段的插入傳遞的,也有可能是質(zhì)粒的傳遞或者藥物選擇作用出現(xiàn)了基因變異；最后解析了整個代謝通路和絕大部分基因的功能,從而發(fā)現(xiàn)產(chǎn)抗生素等次級代謝產(chǎn)物的整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和耐藥相關(guān)基因的分布,從而為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)并從基因組角度解釋細(xì)菌耐藥性、細(xì)菌與藥物相互作用、細(xì)菌與宿主相適應(yīng)性機制等提供新的思路。為我們加強耐藥菌的監(jiān)控及合理使用抗生素提供幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440

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本文編號：2390891