【摘要】：嘌呤生物堿是一類小分子量的含氮化合物,廣泛分布于自然界多種植物中。該類化合物的藥理作用復(fù)雜多樣,已有多種化合物被開發(fā)為臨床藥物,如咖啡因,茶堿等。因此,建立嘌呤生物堿類化合物的生物樣品含量的檢測方法具有重要意義。目前,對嘌呤生物堿類化合物在生物樣本中的常用檢測方法,包括HPLC、LC-MS等,需要較為繁瑣復(fù)雜的樣品前處理過程,儀器設(shè)備較為昂貴,且對樣品檢測無法做到高通量的同時檢測。而利用嘌呤生物堿類化合物的單克隆抗體建立的酶聯(lián)免疫吸附法(enzeyme-linked immunosorbent assay, ELISA),具有檢測生物學(xué)樣品前處理簡單、儀器設(shè)備價格低廉、實驗耗材成本低的特點,可以對樣品中的微量、痕量嘌呤生物堿成分進行高通量同時檢測。本課題選擇嘌呤生物堿類化合物茶堿-7-乙酸(theophylline-7-acetic acid,7-TAA)作為半抗原,制備了抗7-TAA的單克隆抗體,并建立了7-TAA、theacrine、咖啡因的ELISA法。分別利用ELISA法檢測小鼠血清中的7-TAA含量、小鼠血液和腦組織中的theacrine含量和不同市售藥品中的咖啡因含量。本研究所建立的7-TAA、theacrine、咖啡因的ELISA法,對生物樣品中的7-TAA、theacrine.咖啡因的高通量、快速檢測具有重要意義。[目的]1.制備抗茶堿-7-乙酸單克隆抗體。2.利用抗茶堿-7-乙酸單克隆抗體,分別建立7-TAA、theacrine和咖啡因的ELISA法。3.分別利用ELISA法檢測小鼠血清中的7-TAA含量、小鼠血液中的theacrine含量,以及不同市售藥品中的咖啡因含量。[方法]1.采用活潑酯法合成7-TAA的人工抗原,免疫后進行血清抗體檢測。經(jīng)過細胞融合后,篩選并單克隆化分泌抗7-TAA抗體的雜交細胞瘤。采用辛酸硫酸銨法純化腹水,制備抗7-TAA單克隆抗體,考察抗體特異性。2.優(yōu)化包被原濃度、一抗工作濃度、線性檢測范圍,進行方法學(xué)考察及加樣回收率檢測,建立7-TAA、theacrine和咖啡因的ELISA法。3.采用ELISA法檢測小鼠血液中的7-TAA含量、theacrine含量和市售藥品中的咖啡因含量,并與常規(guī)HPLC法檢測結(jié)果比較。4.雄性昆明小鼠10只,按劑量45 mg·kg-1給小鼠灌胃給藥theacrine,分別于給藥后10個時間點,采取尾尖取血方法取血10μg,溶于90μL磷酸鹽緩沖液,采用ELISA法考察theacrine在小鼠血液中的藥代動力學(xué)特征。5.雄性昆明小鼠10只,按劑量45 mg·kg-1給小鼠灌胃給藥theacrine,給藥后35 min斷頭,分別取皮質(zhì)、海馬、下丘腦、腦干和小腦,稱重后加入1.0 mL PBS緩沖液,勻漿離心取上清,采用ELISA法檢測小鼠腦內(nèi)亞器官的theacrine含量,初步探析theacrine在小鼠腦內(nèi)亞器官的分布特征。[結(jié)果]1.成功制備7-TAA人工抗原,經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測,計算其偶聯(lián)比約為23。2.成功獲得分泌抗7-TAA抗體的單克隆細胞株C1183,所分泌抗體特異性強,與theacrine和咖啡因的交叉反應(yīng)率為34.0%和0.3%,與茶堿、可可堿、1,3,9-三甲基尿酸無明顯交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率均0.01)3利用抗7-TAA單克隆抗體建立了7-TAA酶聯(lián)免疫吸附法。線性竟爭范圍為46.8ng·mL-1-3000 ng·mL-1靈敏度為528.43 ng·mL-1,穩(wěn)定性好,孔間差變異系數(shù)7.8%,板間差變異系數(shù)8.5%,平均加樣回收率為99.59%。小鼠血液中7-TAA含量的檢測結(jié)果為1188.97±44.9、812.31±43.0、284.70±16.5ng·mL-1,與HPLC法檢測結(jié)果相關(guān)性高。4利用抗7-TAA單克隆抗體建立了theacrine酶聯(lián)免疫吸附法。線性競爭范圍為156.25ng·mL-1-100μmL-1,靈敏度為1547.6 ng·mL-1,穩(wěn)定性好,孔間差變異系數(shù)8.0%,板間差變異系數(shù)7.7%,平均加樣回收率為99.87%。小鼠血液中theacrine含量的檢測結(jié)果為1254.61±68.8、696.02±33.36、439.57±13.15ng·mL-1,與HPLC法檢測結(jié)果相關(guān)性高。利用1theacrine酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血液中的theacrine代謝曲線,發(fā)現(xiàn)在0.5 h時,theacrine在血液中的藥物濃度達到峰值,2.0 h時出現(xiàn)第二個吸收峰。利用theacrine酶聯(lián)免疫吸附法檢測theacrine在小鼠腦內(nèi)亞器官的分布,發(fā)現(xiàn)下丘腦的theacrine含量最高。5.利用抗7-TAA單克隆抗體建立了咖啡因酶聯(lián)免疫吸附法。線性競爭范圍為7.0μg·mL-1-500μg·mL-1,靈敏度為165.34 μg·mL-1,穩(wěn)定性好,孔間差變異系數(shù)8.7%,板間差變異系數(shù)6.7%,平均加樣回收率為100.5%。市售藥品中的咖啡因含量的檢測結(jié)果為15.003±0.55、30.294±0.91、32.045±0.78mg,與HPLC法檢測結(jié)果相關(guān)性高。[結(jié)論]活潑酯法合成的7-TAA人工抗原免疫效果良好,經(jīng)細胞融合后成功制備抗7-TAA單克隆抗體,建立了7-TAA、theacrine和咖啡因的酶聯(lián)免疫吸附法,可用于檢測小鼠血清中的7-TAA含量、小鼠血液和腦組織中的theacrine含量和不同市售藥品中的咖啡因含量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6

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本文編號：2294774