發(fā)布時間：2018-10-21 07:48

【摘要】：銅綠假單胞菌是機會致病性細菌,近年來由于抗菌藥物的廣泛使用,其耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為國內(nèi)及全球性問題,給臨床感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)。碳青霉烯類是目前被認為最有效的治療多重耐藥革蘭陰性菌的抗菌藥物之一。但是隨著它的廣泛應(yīng)用及不合理使用,銅綠假單胞菌對碳青霉烯類的耐藥率也在不斷增加,這將使得臨床面臨無藥可用的困境。為了給臨床合理使用碳青霉烯類抗菌藥物及制定科學的耐藥預防策略提供參考,本研究采用分子分型方法對國內(nèi)碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌進行流行病學遺傳背景分析,并進一步地探討其耐藥機制。 本研究于2010年1月至2010年12月之間收集了來自全國22個省市,65家醫(yī)院的2818株銅綠假單胞菌,采用紙片擴散法對其進行常規(guī)的16種抗菌藥物體外藥敏試驗。根據(jù)藥敏結(jié)果選擇碳青霉烯類或頭孢他啶不敏感的896株銅綠假單胞菌進行多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)分析,采用DNA拼接軟件和網(wǎng)站鑒定等位基因型(Allele Type)和序列型(Sequence Type, ST),借助BioNumerics軟件對其進行遺傳和多樣性分析。體外藥敏試驗結(jié)果提示亞胺培南(Imipenem, IPM)、美羅培南(Meropenem, MEM)和頭孢他啶(Ceftazidime, CAZ)的耐藥率分別為23.1%、18.1%和15.3%,而其他主要β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率在15-25%左右。MLST結(jié)果提示896株銅綠假單胞菌中,632株細菌屬于116種ST型,201株屬于104種新的已知基因組合,63株含某個或幾個新管家基因型并組成了新的34種ST型。主要的ST型有ST244、ST277、ST235和ST274等。ST型種類與菌株數(shù)量間存在明顯的線性相關(guān),提示ST型種類較多且分散。從BioNumerics軟件生成的最小生成樹分析亦提示這些菌株的克隆型別較多,遺傳背景多樣。 對627株碳青霉烯類耐藥的銅綠假單胞菌進行碳青霉烯類耐藥機制研究。對所有菌株進行PCR篩查常見β內(nèi)酰胺酶基因,對篩查到的金屬酶基因陽性的菌株進行脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)同源性分析,并利用S1核酸酶-PFGE和Southern blot雜交進行基因定位分析。選擇四種不同表型的菌株,即137株IPM-R、MEM-I/S的,40株IPM-I/S、MEM-R的,118株IPM-R、MEM-R的,和75株IPM-S、MEM-S的菌株,采用PCR方法擴增oprD基因全長查看突變型別。另外,挑選9株IPM-R、MEM-I/S的,9株IPM-I/S. MEM-R,9株IPM-R、MEM-R的,和8株IPM-S、MEM-S的菌株,采用實時熒光定量PCR (Quantitive Real-Time PCR, qPCR)方法檢測四種常見RND家族外排泵基因的相對表達量,即MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY。最后采用突變體庫方法探索碳青霉烯類的新耐藥機制。β內(nèi)酰胺酶基因篩查結(jié)果提示627株碳青霉烯不敏感菌株中僅29株菌株碳青霉烯酶陽性,主要是IMP-1、IMP-25和VIM-2、S1-PFGE和Southern blot雜交將其定位于質(zhì)粒上。亞胺培南和美羅培南耐藥菌株中oprD基因均存在不同程度的突變型別,主要突變類型為氨基酸改變型。35株四種不同耐藥表型菌株的外排泵基因表達結(jié)果提示僅2.8%菌株的外排泵高表達。 因此,中國碳青霉烯類不敏感銅綠假單胞菌整體呈現(xiàn)克隆多樣性分布遺傳背景,未出現(xiàn)明顯的克隆流行。碳青霉烯類的主要耐藥原因為oprD基因突變,碳青霉烯酶陽性和外排泵高表達不是主要原因。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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1 胡付品;朱德妹;汪復;蔣曉飛;孫自鏞;陳中舉;胡志東;李金;謝軼;康梅;徐英春;張小江;張朝霞;季萍;王傳清;王愛敏;倪語星;孫景勇;俞云松;林潔;儲云卓;田素飛;徐元宏;沈繼錄;單斌;杜艷;卓超;蘇丹虹;張泓;孔菁;魏蓮花;吳玲;胡云建;艾效曼;;2013年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測[J];中國感染與化療雜志;2014年05期

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本文編號：2284430