發(fā)布時(shí)間：2018-10-12 16:43

【摘要】：研究背景和目的細(xì)菌耐p-內(nèi)酰胺類抗生素的主要機(jī)制是其產(chǎn)p-內(nèi)酰胺酶,導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素(如青霉素、頭孢菌素類抗生素)水解或活性減少。β-內(nèi)酰胺酶主要包括超廣譜p-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)及碳青霉烯酶,產(chǎn)上述酶的細(xì)菌廣泛播散與流行,使得β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重,已成為全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題。尤其是碳青霉烯酶的出現(xiàn)及迅速傳播,導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥,幾乎突破了臨床抗感染治療的最后一道防線。目前三種主流的碳青霉烯酶：Ambler分類中的A類(KPC)、B類(金屬酶)以及D類(OXA-48型)。KPC型碳青霉烯酶于2001年在美國(guó)北卡羅來(lái)納首次被發(fā)現(xiàn),到目前已發(fā)展了KPC-1～KPC-17共17種亞型,它們之間只有個(gè)別氨基酸發(fā)生突變,其中KPC-2為存在的主要亞型。KPC型的編碼基因blaKPC主要存在于細(xì)菌質(zhì)粒上,可在不同菌種間傳播,攜有blaKPC質(zhì)粒的腸道細(xì)菌可定植于患者體內(nèi)并通過(guò)交通運(yùn)輸迅速播散,質(zhì)粒編碼的blaKPC現(xiàn)幾乎已在全球各地廣泛流行。在我國(guó),浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院分別于2007年與2011年報(bào)道了國(guó)內(nèi)第一例產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌和第一例產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌,而我院尚無(wú)該型碳青霉烯酶的報(bào)道及研究；D類酶中的OXA-48型碳青霉烯酶主要在地中海及歐洲南部國(guó)家快速蔓延；而B類碳青霉烯酶,又稱金屬酶,其中NDM型金屬酶可高效水解除替加環(huán)素和多粘菌素外的所有抗生素,目前有NDM-1～NDM-10共10個(gè)亞型,最常見(jiàn)的是NDM-1型,NDM-1現(xiàn)已波及多個(gè)菌種：肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、沙雷氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬等,這些攜帶有耐藥基因blaNDM-1的臨床的主要致病菌是嚴(yán)重創(chuàng)傷、敗血癥、手術(shù)后相關(guān)感染的巨大潛在威脅,尤其是人們生活中普遍存在的大腸桿菌(社區(qū)獲得性感染、泌尿系統(tǒng)感染及細(xì)菌性腹瀉的主要致病菌)被發(fā)現(xiàn)可攜帶耐藥基因blaNDM-1.相關(guān)報(bào)道還指出blaNDM-1基因常與其他β-內(nèi)酰胺酶基因共存于細(xì)菌可轉(zhuǎn)移的基因元件上,使多重耐藥性廣泛傳播,導(dǎo)致攜帶該類基因的細(xì)菌成為全球公共衛(wèi)生威脅。2010年印度、巴基斯坦、英國(guó)等國(guó)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,產(chǎn)MDM-1的腸桿菌科細(xì)菌占所檢測(cè)細(xì)菌的1.2%-13%,主要菌種為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌、摩氏摩根、普羅維登斯菌屬;相比國(guó)外研究發(fā)現(xiàn),我國(guó)blaNDM-1陽(yáng)性細(xì)菌菌種較為局限,見(jiàn)于不動(dòng)桿菌,且檢測(cè)率相對(duì)較低,浙江大學(xué)傅鷹對(duì)我國(guó)2009年1月至2010年9月的臨床分離的12024株革蘭陰性桿菌blaNDM-1的篩查結(jié)果顯示,共篩出13株blaNDM-1陽(yáng)性的細(xì)菌,且均為不動(dòng)桿菌,總檢出率僅為0.1%；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院王雪松等對(duì)我國(guó)2011年1月-10月來(lái)自11個(gè)省市52家醫(yī)院的10273份糞便標(biāo)本進(jìn)行blaNDM-1基因的篩查結(jié)果顯示,blaNDM-1的總檢出率高達(dá)14.8%,對(duì)其中120株陽(yáng)性菌進(jìn)行鑒定分析發(fā)現(xiàn)無(wú)肺炎克雷伯菌和大腸桿菌。近年我國(guó)臨床分離菌產(chǎn)NDM碳青霉烯酶的具體分型、陽(yáng)性菌種分布,及同時(shí)攜帶其他p-內(nèi)酰胺酶基因的情況,目前缺乏系統(tǒng)的流行病學(xué)研究。本研究的目的是：第一,初步了解近年我國(guó)產(chǎn)NDM型的細(xì)菌的檢出率、具體NDM碳青霉烯酶分型、陽(yáng)性菌種分布及相關(guān)陽(yáng)性細(xì)菌的常見(jiàn)p-內(nèi)酰胺酶基因的攜帶情況；第二,對(duì)我院未檢出blaNDM基因的耐藥細(xì)菌,進(jìn)行blaKPC篩查,了解我院blaKPC基因的檢出情況、碳青霉烯酶KPC的具體分型及相關(guān)陽(yáng)性細(xì)菌的常見(jiàn)p-內(nèi)酰胺酶基因的攜帶情況,并進(jìn)一步研究耐藥基因的傳播性與耐藥性。方法第一部分研究?jī)?nèi)容：1.菌株收集收集全國(guó)38個(gè)城市61家醫(yī)院2009年1月-2014年3月臨床分離的1150株耐碳青霉烯類抗生素的無(wú)重復(fù)的革蘭氏陰性菌,包括不動(dòng)桿菌541株、肺炎克雷伯菌178株、假單胞菌屬241株及其他腸桿科細(xì)菌190株。菌株來(lái)源為便、痰、尿、血、分泌物、導(dǎo)管、引流液等臨床標(biāo)本。送檢標(biāo)本經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和抗生素的最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定,參照CLSI-2013的判斷折點(diǎn)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、陰溝腸桿菌ATCC 700323、銅綠假單胞菌ATCC 27853。2.耐藥基因篩查PCR初篩blaNDM基因,陽(yáng)性菌株進(jìn)行常見(jiàn)的其他β-內(nèi)酰胺酶基因篩查,包括碳青霉烯酶基因：blaGES、blaKPC、blaIMI、blaBIC、blaIMP、 blaVIM、blaTMB、blaFIM、blaDIM、blaSIM、blaAIM、blaSMB、blaOXA-23like、 blaOXA-24-like、eblaOXA-48-like 、eblaOXA-58-like 、eblaOXA-143-like 、eblaOXA-235-like 、ESBLs基因：blaCTM-M-1group、blaCTM-M-2group、blaCTM-M-8group、blaCTM-M-9group、blaCTM-M-25group、blaCTM、 blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOCA-1-like.相關(guān)陽(yáng)性基因的測(cè)序比對(duì)以確定亞型,并重點(diǎn)對(duì)blaNDM基因進(jìn)行全序測(cè)定比對(duì)及發(fā)育樹構(gòu)建,確定亞型及同源性關(guān)系。3.菌種鑒定聯(lián)合應(yīng)用特異基因擴(kuò)增、16SrDNA擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)、rpoB擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)及MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)blaNDM基因陽(yáng)性細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定,以確保鑒定到種水平。第二部分研究?jī)?nèi)容：1.菌株選取我院分離自2013年6月-9月的155株耐碳青霉烯類抗生素的無(wú)重復(fù)革蘭陰性菌,菌株分離自便、痰、尿、血、分泌物、導(dǎo)管、引流液等臨床標(biāo)本,包括不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬及其他菌株。以上菌株于第一部分研究中未篩出blaNDM基因。2.耐藥基因篩查及傳播機(jī)制研究PCR初篩blaKPC基因,陽(yáng)性菌株進(jìn)行常見(jiàn)的其他β-內(nèi)酰胺酶基因篩查,包括碳青霉烯酶基因：blaGEC、blaIMI、blaBIC、 blaIMP、blaVIM 、blaTMB、blaFIM、blaSPM、blaDIM、blaGIM、blaSIM、blaAIM、blaSMB、 blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-48-lke、blaOXA-58-like、blaOXA-143-like、blaOXA-235-like ESBLs基因：blacTX-M-lgroup、blaCTX-M-2group、blaCTX-M-8group、blaCTX-M-9-group、 BLaCTX-M-25group、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1-like;相關(guān)陽(yáng)性基因的測(cè)序比對(duì)以確定亞型,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、Carba NP實(shí)驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)驗(yàn)證陽(yáng)性耐藥基因的傳播性。3.菌種鑒定應(yīng)用特異基因擴(kuò)增、16SrDNA擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)及MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)blaKPC基因陽(yáng)性的菌株進(jìn)行菌種鑒定,以保證鑒定準(zhǔn)確性。結(jié)果第一部分研究結(jié)果：1 .blanDM基因檢出情況共檢出46株blanDM基因陽(yáng)性的細(xì)菌,總檢出率為4%。陽(yáng)性菌株分離標(biāo)本包括糞便16株、痰標(biāo)本16株、尿標(biāo)本6株、血培養(yǎng)4株、分泌物2株、導(dǎo)管培養(yǎng)1株、引流液1株,來(lái)自14個(gè)不同城市及15個(gè)不同的科室。所有基因均為blaNDM-1型。陽(yáng)性菌株包括11株湯氏不動(dòng)桿菌、2株魯菲不動(dòng)桿菌、2株鮑曼不動(dòng)桿菌、3株皮特不動(dòng)桿菌、1株約翰遜不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌11株,弗氏枸櫞酸桿菌6株,大腸埃希菌4株,陰溝腸桿菌、非脫羧勒克菌各2株,解鳥氨酸拉烏爾菌、產(chǎn)氣腸桿菌各1株。2.其他β-內(nèi)酰胺酶基因檢出情況blaNDM-1基因陽(yáng)性菌株其他p-內(nèi)酰胺酶基因檢出結(jié)果：2株弗氏枸櫞酸桿菌blaKPC-2基因陽(yáng)性；6株湯氏不動(dòng)桿菌和2株皮特不動(dòng)桿菌blaOCA-s58基因陽(yáng)性；1株弗氏枸櫞酸桿菌blaIMP-4基因陽(yáng)性；1株肺炎克雷伯菌和1株弗氏枸櫞酸桿菌blaCTX-M-1 group中的blaCTX-M-15基因陽(yáng)性,6株肺炎克雷伯菌、2株弗氏枸櫞酸桿菌、1株大腸桿菌、1株非脫羧勒克菌、1株陰溝腸桿菌blaCTX-M-1group中的blaCTX-M-3基因陽(yáng)性；16株blaTEM基因陽(yáng)性,包括7株肺炎克雷伯菌、4株弗氏枸櫞酸桿菌、2株大腸桿菌、2株陰溝腸桿菌及1株非脫羧勒克菌；4株肺炎克雷伯菌、1株陰溝腸桿菌blaSHV-2基因陽(yáng)性,1株肺炎克雷伯菌blaSHV-5基因陽(yáng)性；13株細(xì)菌blaoxA-1基因陽(yáng)性,包含4株肺炎克雷伯菌、4株弗氏枸櫞酸桿菌、2株湯氏不動(dòng)桿菌、1株大腸桿菌、1株陰溝腸桿菌及1株非脫羧勒克菌。第二部分研究結(jié)果：研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株分離自患者痰標(biāo)本的攜帶有blaKPC和blaSHV基因的肺炎克雷伯菌和1株分離自患者尿標(biāo)本的攜帶blaKPC基因的銅綠假單胞菌。對(duì)陽(yáng)性基因擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)blaKPC均為blaKPC-2型,blaSHV為blASHV-11型。通過(guò)電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了blaKPC-2基因的可轉(zhuǎn)移性,同時(shí)應(yīng)用CarbaNP實(shí)驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因可于轉(zhuǎn)化子中成功表達(dá)A型β-內(nèi)酰胺酶,導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。結(jié)論我國(guó)近年產(chǎn)NDM-1菌株的檢出率高達(dá)4%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2009-2010年的0.1%,同時(shí)攜帶blaNDM-1的細(xì)菌不再局限于不動(dòng)桿菌屬,而是廣泛涉及腸桿科細(xì)菌,包括肺炎克雷菌、大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等。對(duì)blaNDM-l基因的全序擴(kuò)增及對(duì)應(yīng)氨基酸序列的發(fā)育樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn),檢出的blaNDm-1基因序列表達(dá)的氨基酸序列完全一致,同源性一致。我國(guó)攜帶blaNDM-1的細(xì)菌所含的耐藥基因復(fù)雜,可同時(shí)攜帶多種其他β-內(nèi)酰胺酶基因：blACTX-M-1group、blaOXA-1-like、blaSHV、blaIMP、 blaKPCc及blaOXA-58-like的一個(gè)或多個(gè)。我院檢測(cè)的155株耐藥菌株未檢出blaNDM基因,但發(fā)現(xiàn)可隨質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的碳青霉烯酶基因blaKPC-2,該基因能夠使轉(zhuǎn)化子成功表達(dá)A型p-內(nèi)酰胺酶,導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥,同時(shí)發(fā)現(xiàn)我院blaKPC-2基因可與blaSHV-11基因共同存在于細(xì)菌中,只是blaSHV-11并未在轉(zhuǎn)化子中表達(dá),考慮該基因可能位于細(xì)菌染色體上或不位于攜帶的blaKPCt-2的質(zhì)粒上。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2266856