發(fā)布時間：2018-08-02 11:55

【摘要】：研究背景造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)是指通過大劑量化學(xué)治療(簡稱化療)和／或放射治療(簡稱放療)預(yù)處理,清除受者體內(nèi)的腫瘤／異常細(xì)胞和造血／免疫細(xì)胞,再將自體或異體骨髓細(xì)胞移植給受者,使受者重建造血及免疫系統(tǒng)。HSCT主要分為自體移植和異體移植(包括異基因和同基因),根據(jù)來源又可分為骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)、外周血干細(xì)胞移植(peripheral blood stem cell transplantation, PBSCT)和臍血移植(cord blood transplantation, CBT),廣泛用于治療惡性血液病、非惡性血液病、遺傳性疾病、某些實體瘤和自身免疫性疾病。HSCT后造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)快速有效的重建意義重大,可直接影響移植效果、生存率和患者的生存質(zhì)量。目前可能促進(jìn)HSCT后造血和免疫重建的策略有：(1)增加移植的細(xì)胞量：HSCT后造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的歸巢和植入直接影響了移植后造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的重建,增加移植的細(xì)胞量,可以提高歸巢和植入的HSCs的總數(shù)量。但根據(jù)文獻(xiàn)報道,骨髓中HSCs比例極低,僅約1%,故增加移植細(xì)胞量的同時也輸入了大量異體細(xì)胞,增大了出現(xiàn)移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的機(jī)率,增加移植并發(fā)癥的發(fā)生,嚴(yán)重時甚至可危及患者的生命；(2)移植純化的HSCs:移植純化的HSCs可增加HSCT細(xì)胞中HSCs的比例,提高HSCs的歸巢率和植入率。但HSCs的分離純化成本高,難度系數(shù)大。而且相關(guān)研究也表明,HSCT后不僅HSCs在造血和免疫恢復(fù)中起作用,一些間質(zhì)細(xì)胞也起著重要的作用,過度純化反而可能會影響移植的效果；(3)使用體外擴(kuò)增的HSCs進(jìn)行移植：體外擴(kuò)增可獲得大量相對較純的HSCs,用其進(jìn)行移植可顯著提高HSCs的歸巢率和植入率。但相關(guān)研究表明HSCs在體外擴(kuò)增的過程中,其表面抗原和部分特性可能發(fā)生改變,移植入體內(nèi)后造血重建效果不佳；(4)骨髓腔內(nèi)注射移植(intra-bone marrow injection, IBM-BMT):自2001年Kushida等報道骨髓腔內(nèi)注射HSCs移植可提高移植后HSCs的歸巢率以來,后續(xù)大量研究者們也反復(fù)進(jìn)行了相關(guān)研究和嘗試,證實相較于靜脈移植,骨髓腔內(nèi)注射移植可明顯提高移植后HSCs的歸巢率和機(jī)體的生存率,同時可相對減少移植所需的細(xì)胞量,進(jìn)而減少GVHD的發(fā)生：(5)提高HSCs歸巢至骨髓的比例：此策略頗具前景,亦為本課題提出靶向移植思路的來源。機(jī)體在常規(guī)接受靜脈輸注移植后,HSCs隨著血液循環(huán)至全身組織并大量被阻滯在肺臟、肝臟、脾等器官內(nèi),僅有少量HSCs歸巢至骨髓,植入并分裂分化,逐漸完成造血和免疫重建。如何讓HSCs大量定向歸巢至骨髓,且在骨髓局部長時間停留,提高植入率?本課題探索以磁力誘導(dǎo)細(xì)胞靶向移植(Magnetism-induced cell target transplantation, Magic-TT)來達(dá)到這個目的。Magic-TT是指將移植的造血細(xì)胞磁化標(biāo)記,HSCT后在靶器官(骨髓)局部短期施加一個適宜強(qiáng)度的磁場,磁化的細(xì)胞在磁力的作用下,迅速進(jìn)入靶器官(骨髓),在局部停留并定植,此時再撤去磁場,細(xì)胞可繼續(xù)增殖、分化或遷移至其它部位。Magic-TT的優(yōu)勢如下：(1)可能提高移植細(xì)胞的歸巢率,縮短造血和免疫重建時間,提高生存率；(2)聯(lián)合骨髓腔內(nèi)(Intra-bone marrow, IBM)注射移植,可能進(jìn)一步提高移植后細(xì)胞的歸巢率,從而減少移植的細(xì)胞量,減少GVHD的發(fā)生率,提高生存質(zhì)量。研究目的1.建立eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植模型,觀察移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位。2.建立eGFP和mRFP雙熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠異基因骨髓移植模型,觀察移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位。3.在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植模型中,探索Magic-TT是否可提高移植后細(xì)胞的歸巢率,縮短造血和免疫重建時間。研究內(nèi)容第一部分eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位[方法](1)20只C57BL/6受者雌性普通小鼠,隨機(jī)分為實驗組和對照組,各10只,移植前腸道準(zhǔn)備；(2)5只C57BL/6雄性eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因供者小鼠,脫臼后取雙側(cè)股骨,制備成骨髓懸浮液；(3)兩組小鼠經(jīng)7Gy強(qiáng)度清髓性放療后,實驗組尾靜脈輸注O.1ml骨髓液,細(xì)胞數(shù)約(5×106)／只,對照組尾靜脈輸注0.1mlPBS；(4)移植后觀察兩組小鼠的一般情況、植入水平、造血恢復(fù)和生存期等。在受鼠造血恢復(fù)的過程中,取股骨半固體脫鈣后,用共聚焦顯微鏡等觀察骨髓中供者綠熒光細(xì)胞的分布、形態(tài)和定位等。[結(jié)果](1)實驗組小鼠的造血恢復(fù)為(19.87±1.81)天,外周血中RFP+比例為(92.67±6.65)%；(2)對照組移植后第5天開始有小鼠死亡,第11天全部死亡,中位生存期為7.5d,死亡原因為造血衰竭,死亡時外周血白細(xì)胞均0.5×109/L,病死率達(dá)100%；(3)受鼠股骨經(jīng)半固體脫鈣后,直接在共聚焦顯微鏡下可清晰的觀察到骨髓腔中供者綠熒光細(xì)胞的形態(tài)和空間分布。[小結(jié)]本部分實驗使用eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠成功構(gòu)建了eGFP-普通小鼠的同基因骨髓移植模型。供者細(xì)胞自帶綠熒光,該模型有助于探索移植后供者細(xì)胞在受者體內(nèi)的遷移和分布,同時結(jié)合本團(tuán)隊自創(chuàng)的半固體脫鈣法,在緩慢脫鈣的過程中半固體成分輕微流動,作為支撐成分逐步替代股骨中的鈣質(zhì)成分,原位保留了股骨中供者細(xì)胞的位置、形態(tài)和熒光,在共聚焦顯微鏡下可清晰地觀察到移植后受鼠骨髓中供者細(xì)胞的分布、形態(tài)和地位,為探索移植后受鼠骨髓中供者細(xì)胞的分布、歸巢和尋找造血干細(xì)胞“龕”的位置提供了新的思路,具有應(yīng)用價值。第二部分eGFP和mRFP雙熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠異基因骨髓移植后骨髓腔內(nèi)HSCs的空間分布和定位[方法](1)20只C57BL/6雌性eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠,隨機(jī)分為實驗組和對照組,各10只,移植前腸道準(zhǔn)備；(2)5只FVB雄性：nRFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因供者小鼠,脫臼后取雙側(cè)股骨,制備成骨髓懸浮液；(3)兩組小鼠經(jīng)7.5Gy強(qiáng)度清髓性放療后,實驗組尾靜脈輸注0.2m1骨髓液,細(xì)胞數(shù)約(5.0×106)/只,對照組尾靜脈輸注0.2ml PBS;(4)移植后觀察兩組受鼠的一般情況、植入水平、造血恢復(fù)、移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率和生存期。在受鼠造血恢復(fù)的過程中,取股骨半固體脫鈣,用共聚焦顯微鏡等觀察骨髓中紅綠細(xì)胞的分布、形態(tài)和相互作用關(guān)系。[結(jié)果](1)實驗組小鼠的造血恢復(fù)為(20.00±3.07)天,外周血中RFP+比例為(93.94±1.59)%；1個月內(nèi)4/10只受鼠有aGVHD表現(xiàn)；(2)對照組移植后第5天開始有小鼠死亡,第11天全部死亡,中位生存期為8.5d,死亡原因為造血衰竭,死亡時外周血白細(xì)胞均0.5×109/L,病死率達(dá)100%。(3)受鼠股骨經(jīng)半固體脫鈣后,共聚焦顯微鏡下可見骨髓腔中mRFP+細(xì)胞主要位于骨小梁周圍且被大量的GFP+細(xì)胞所包繞,三維構(gòu)建后可清楚地觀察到骨髓微環(huán)境中紅綠熒光細(xì)胞的相互作用。[小結(jié)]本部分實驗使用eGFP和mRFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠成功構(gòu)建了mRFP→eGFP的雙熒光小鼠異基因骨髓移植模型,結(jié)合半固體脫鈣法可清晰的觀察到移植后骨髓中供者細(xì)胞的分布及供受者細(xì)胞間的相互關(guān)系,為臨床觀察移植后供者細(xì)胞的分布、歸巢等相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。第三部分Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植中的研究[方法](1)40只C57BL/6受者雌性普通小鼠,隨機(jī)分為4組,分別為A組：尾靜脈+磁珠組、B組：尾靜脈+磁珠+小磁場組、C組：尾靜脈+磁珠+中磁場組、D組：尾靜脈+磁珠+大磁場組,各10只,移植前腸道準(zhǔn)備；(2)5只C57BL/6雄性eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因供者小鼠,脫臼后取雙側(cè)股骨,制備成骨髓懸浮液；(3)骨髓懸浮液中先后加入Anti-Sca-1-FITC、Anti-FITC磁珠孵化,使骨髓細(xì)胞中HSCs盡可能多的被納米磁珠標(biāo)記；(4)4組小鼠經(jīng)7Gy強(qiáng)度清髓性放療后,均分別尾靜脈輸注0.1ml含納米磁珠的骨髓液,細(xì)胞數(shù)約(5×106)／只；(5)4組小鼠在移植后分別在股骨處不加磁場、加上弱磁場、中磁場和強(qiáng)磁場,24h后去除磁場；(6)觀察4組小鼠的一般情況,監(jiān)測體重、血常規(guī)、嵌合率、生存期等。[結(jié)果]小鼠于照射后體重進(jìn)行性下降,伴活動減少,1周后精神、活動逐漸恢復(fù),磁場組的部分小鼠磁鐵脫落,部分小鼠因磁鐵夾閉過緊而導(dǎo)致下肢紅腫甚至骨折。(1)4組小鼠的生存情況分別為：A組對照組移植后d17死亡2只,余生存時間30d,存活率80%；B組弱磁場組小鼠全部存活,生存時間30d,存活率100%；C組中磁場組移植后d15死亡1只,余生存時間30d,存活率90%；D組強(qiáng)磁場組移植后d11死亡1只,余生存時間30d,存活率90%。4組小鼠移植后的生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(2)4組小鼠造血基本恢復(fù)時,外周血中RFP+比例分別為(91.35±9.81)%、(95.13±1.50)%、(94.23±0.86)%、(91.53±3.30)%,表明移植成功。(3)將4組小鼠移植后的血常規(guī)進(jìn)行比較：白細(xì)胞P=0.0810.05,無統(tǒng)計學(xué)差異；血紅蛋白P=0.3280.05,無統(tǒng)計學(xué)差異；血小板P=0.0070.05,有明顯統(tǒng)計學(xué)差異,進(jìn)行組間的多重比較,A組與B組P=0.1430.05、A組與C組P為=0.6240.05,均無統(tǒng)計學(xué)意義,A組與D組P=0.0260.05,有明顯統(tǒng)計學(xué)差異,且D組平均血小板數(shù)高于A組,B組與C組P=0.0100.05,有明顯統(tǒng)計學(xué)差異,且B組平均血小板數(shù)高于C組,D組與C組P=0.0000.05,有明顯統(tǒng)計學(xué)差異,且D組平均血小板數(shù)高于C組,B組與D組P=0.1550.05,無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。[小結(jié)]本部分實驗在第一章eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植的基礎(chǔ)上,將供者小鼠的骨髓細(xì)胞磁化+受者小鼠的股骨部位加入不同梯度的磁場,探索在磁場的作用下對小鼠移植后造血恢復(fù)的影響。結(jié)果初步表明在本次實驗所使用的磁場強(qiáng)度范圍內(nèi),Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植中,對白細(xì)胞和血紅蛋白的恢復(fù)無明顯影響,但隨著磁場強(qiáng)度的增大,當(dāng)達(dá)到一定磁場強(qiáng)度后可以縮短移植后血小板的造血恢復(fù)時間,這對改善移植后機(jī)體的造血恢復(fù)有重要意義。結(jié)論和展望通過以上三部分的實驗研究,分別成功建立了eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植模型、紅綠雙熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠異基因骨髓移植模型。在以上兩種模型的基礎(chǔ)上,結(jié)合自創(chuàng)的半固體脫鈣體系,清晰地觀察到移植后骨髓腔內(nèi)紅綠熒光細(xì)胞的位置、形態(tài)及供受者細(xì)胞間的相互作用關(guān)系。本實驗采用了熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行移植,供受者小鼠細(xì)胞自帶紅綠熒光便于觀察,該模型的建立對探索移植后供者細(xì)胞在受者小鼠體內(nèi)的分布、遷移、滯留等相關(guān)研究提供了極大便利,具有重要意義。同時結(jié)合自創(chuàng)的半固體脫鈣體系,使直接觀察移植后小鼠骨髓腔內(nèi)供受者細(xì)胞的位置、形態(tài)及相互作用關(guān)系更加清楚,為追蹤移植后HSCs的歸巢和探索移植后小鼠造血恢復(fù)過程中供受者細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中的相互作用提供了更廣闊的思路,具有重大意義。本實驗的第三部分探索了Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因骨髓移植中,對移植后小鼠造血恢復(fù)的影響,初步證實了Magic-TT在本次實驗所使用的磁場強(qiáng)度范圍內(nèi)對白細(xì)胞和血紅蛋白的恢復(fù)無明顯影響,但隨著磁場強(qiáng)度的增大,當(dāng)達(dá)到一定磁場強(qiáng)度后可以縮短移植后血小板的造血恢復(fù)時間,其深入研究和進(jìn)一步完善將會為臨床改善移植后患者血小板的恢復(fù)情況提供良好的方法,具有重要的臨床應(yīng)用價值。后期本課題的延續(xù)將考慮使用Magic-TT聯(lián)合骨髓腔內(nèi)移植(Intra-bone marrow, IBM),我們預(yù)測兩者的聯(lián)合可能進(jìn)一步提高移植后HSCs的歸巢率,減少移植的細(xì)胞量,縮短移植后的造血恢復(fù)時間,同時減少GVHD的發(fā)生,從而提高總體生存率,改善生存質(zhì)量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R457.7

【共引文獻(xiàn)】

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7 王t，

本文編號：2159349