本文選題：基于 + 磁性��； 參考：《東南大學》2015年博士論文

【摘要】：基于磁性納米顆粒的細胞,細菌和病毒核酸的提取方法研究核酸(NA)提取是進行遺傳研究和DNA傳感器開發(fā)的關鍵步驟。核酸抑制劑的存在會妨礙核酸的下游應用。這些鹽離子和其他有機污染物給DNA生物傳感器的開發(fā)及靈敏的分析提出了挑戰(zhàn)。我們提出了基于磁珠分離核酸的方法,并對可能影響核酸分離的因素進行了優(yōu)化。結果表明,6M的胍鹽酸鹽的濃度為分離核酸的最優(yōu)濃度,核酸的裂解緩沖液和濃度和pH與核酸產量成負相關,核酸產量為在pH 4-5的環(huán)境下相對穩(wěn)定�？梢钥闯�,使用carrier RNA在病毒基因組分離中是十分重要的。當加入1：1的比例乙醇至溶解物能夠大大提高核酸產量。無DNA酶和RNA酶水,1×TE緩沖液和2×PCR緩沖液洗脫效率進行比較可以看出,carrier RNA在DNA酶和RNA酶自由水和1×TE緩沖液中洗脫效率最佳。從大量的細胞中提取核酸用較大的洗脫緩沖液的體積洗脫效果更佳。本研究建立了一種簡單的方法,從細胞,細菌和血清提取核酸。將純化的核酸成功擴增PCR中和RT-PCR,以驗證此方法的可靠性。使用納米顆�？梢源龠M使用這種方法在自動化核酸提取儀開發(fā)和應用,可用于高通量半自動或全自動診斷系統的發(fā)展�；赑CR擴增和化學發(fā)光乙肝病毒的高靈敏度檢測HBV感染已被認為可以引發(fā)一系列嚴重的疾病,如肝細胞癌(HCC),肝內膽管細胞癌和非霍奇金淋巴瘤。對這一感染的早期診斷對疾病的治療以及抑制疾病傳播至關重要。目前的分子檢測系統價格昂貴,而且需要高技能的勞動力進行測試和處理數據。本研究提出了一個通過結合磁分離,多重PCR和化學發(fā)光技術的高靈敏度、可自動化檢測臨床樣品乙肝病毒檢測方法。對可能影響PCR的因素,如引物濃度,PCR緩沖液濃度,氯化鎂濃度(MgCl2),引物的Taq DNA聚合酶的濃度和PCR的退火溫度進行優(yōu)化,以獲得最大的產量。探針-模板雜交溫度進行了探索研究,最終得到雜交溫度為45℃。優(yōu)化的探針濃度為5μM。最佳雜交時間被確定為30分鐘。用50μg探針修飾的磁珠產生最大化學發(fā)光信號。當用HCV和HIV感染的血清替換HBV血清時,檢測獲得陰性信號。該方法可檢測10病毒拷貝/毫升血清的HBV病毒,有很好的靈敏度�；赑CR擴增和化學發(fā)光丙肝病毒的高靈敏度檢測丙型肝炎病毒(HCV)是全世界的主要威脅之一。感染了這種病毒會導致慢性肝炎,肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的發(fā)生。研發(fā)成本低廉的診斷工具,以便及早發(fā)現丙型肝炎病毒的發(fā)展是在發(fā)展中國家是非常必要的。本研究建立了一種基于磁性納米顆粒和化學發(fā)光的HCV檢測方法。利用一步法逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)對HCV-RNA進行擴增,以實現較高的靈敏度的檢測。PCR的引物退火溫度被確定為58℃。在1.5×PCR緩沖液濃度下,獲得最佳的擴增效果。同時對MgCl2和引物的濃度進行了優(yōu)化,最佳濃度分別2.4州和200 nM。熱啟動Taq DNA聚合酶的最佳用量為1.5U/50μl。探針和模板雜交的最佳在溫度為55℃。最適探針濃度為5μM。當雜交在30分鐘時記錄得到最大的化學發(fā)光信號。該方法成功地檢測到10病毒顆粒/毫升血清,有較好的特異性和靈敏度�；诖判苑蛛x和化學發(fā)光的艾滋病毒檢測方法研究人類免疫缺陷病毒(HIV)是一種感染人類免疫系統細胞的致病病毒。自從艾滋病病毒被發(fā)現至信今已造成超過2500萬人死亡,每年報告新增艾滋病毒感染者270萬。因此,研究一種新的廉價有效的HIV病毒診斷方法極為重要。本研究介紹了一種基于DNA雜交和化學發(fā)光的HIV檢測分析。利用一步法反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)用于擴增的HIV靶序列。最佳退火溫度為58℃。Biotin-11-dUTP摻入到一步法RT-PCR擴增反應中,使擴增產物標記上Biotin。探針修飾的磁珠被用來捕獲這些靶序列,并生成檢測信號。本論文對可能會影響化學發(fā)光信號的不同因素進行了優(yōu)化,最后得到最佳雜交溫度是35℃。5μM的探針濃度產生最大的化學發(fā)光信號。最佳雜交時間為30分鐘。這種方法顯示出良好的特異性。當HCV和HBV感染的血清替換HIV血清時,得到的陰性信號。該系統成功地檢測到10病毒拷貝／毫升HIV血清�；诖判约{米顆粒和化學發(fā)光分析同時提取和檢測多種病毒相比于酶聯免疫(ELISA)測定方法,基于核酸檢測的方法更為靈敏。多種試驗方法已經被用于檢測多種病原體,并能降低核酸檢測的成本。但是,這些測定法無法可靠地檢測大量病原體。在本研究中,建立了一個基于DNA雜交的化學發(fā)光檢測方法,被并用于同時檢測多種病原體而對病原體的數目沒有限制。通過開展HBV, HCV和HIV的同時提取和檢測,探頭具有較高的特異性可捕獲病毒序列。在其它病毒有更高負載的存在時仍可檢測到單個病毒,該試驗可以檢測10拷貝/毫升血清10拷貝／毫升HCV血清和100拷貝/毫升HIV血清�；诖欧蛛x技術從核酸提取到化學發(fā)光檢測,該方法可以整合到一個自動化系統用于便捷地高通量病原休檢測。
[Abstract]:Extraction of cells, bacteria and virus nucleic acids based on magnetic nanoparticles study of nucleic acid (NA) extraction is a key step in genetic research and the development of DNA sensors. The presence of nucleic acid inhibitors hinders the downstream application of nucleic acids. The development and sensitive analysis of these salt ions and other organic pollutants to DNA biosensors The challenge. We propose a method based on magnetic bead separation of nucleic acid and optimize the factors that may affect nucleic acid separation. The results show that the concentration of guanidine hydrochloride in 6M is the optimal concentration of nucleic acid separation, the buffer solution and the concentration and pH of nucleic acid are negatively correlated with the yield of nucleic acid, and the yield of nucleic acid is relatively stable in the environment of pH 4-5. It is evident that the use of carrier RNA is very important in the isolation of the virus genome. When the proportion of ethanol into the 1:1 can greatly increase the yield of nucleic acid, no DNA and RNA water, 1 x TE buffer and 2 x PCR buffer elution efficiency can be compared, carrier RNA is found in the DNA enzyme and RNA enzyme free water and 1 * TE buffer solution. Elution efficiency is best. Extraction of nucleic acids from a large number of cells is better than the size of a larger elution buffer. A simple method is established to extract nucleic acids from cells, bacteria and serum. The purified nucleic acid is successfully amplified by PCR neutralization and RT-PCR to verify the reliability of the method. This method is developed and applied in an automated nucleic acid extraction instrument, which can be used for the development of high throughput semi-automatic or fully automated diagnostic systems. Detection of HBV infection based on PCR amplification and high sensitivity of chemiluminescent HBV has been considered to lead to a series of serious diseases, such as hepatocellular carcinoma (HCC), intrahepatic cholangiocarcinoma and non Hodgkin drenching. The early diagnosis of this infection is essential for the treatment of the disease and the suppression of the spread of the disease. The current molecular detection system is expensive and requires highly skilled labor to test and process data. This study proposes a high sensitivity by combining magnetic separation, multiple PCR and chemiluminescence technology, which can be automated. Detection of hepatitis B virus detection methods in clinical samples. The factors that may affect PCR, such as primer concentration, PCR buffer concentration, magnesium chloride concentration (MgCl2), Taq DNA polymerase and PCR annealing temperature, are optimized to obtain the maximum yield. Probe template hybridization temperature was explored, and finally the hybridization temperature was 45 The optimum hybridization time of the probe was 5 mu M. and the best hybridization time was determined to be 30 minutes. The maximum chemiluminescence signal was produced by the magnetic beads modified with 50 micron g probes. When the serum HCV and HIV infected serum were replaced with HBV sera, the negative signals were detected. This method can detect the HBV virus of the copy / milliliter serum of the virus. It has a good sensitivity. Based on the PCR expansion, the method has a good sensitivity. The high sensitivity of increasing and chemiluminescence hepatitis C virus (HCV) detection is one of the major threats to the world. Infection of the virus can lead to chronic hepatitis, cirrhosis and primary hepatocellular carcinoma (HCC), and the development of low cost diagnostic tools for the development of hepatitis C virus in developing countries is in developing countries. It is necessary to establish a HCV detection method based on magnetic nanoparticles and chemiluminescence. HCV-RNA is amplified by one step reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to achieve high sensitivity. The annealing temperature of the primer of.PCR is determined to be 58. The optimum results are obtained at the concentration of 1.5 x PCR buffer. At the same time, the concentration of MgCl2 and primers was optimized. The optimum concentration of the optimum concentration of 2.4 state and 200 nM. Taq DNA polymerase was the optimum at the 1.5U/50 Mu L. probe and the template hybridization at the temperature of 55. The optimum probe concentration was 5 mu M. when the maximum chemiluminescence signal was recorded when the hybridization was 30 minutes. The human immunodeficiency virus (HIV) is a pathogenic virus infected with the human immune system cells. Since the discovery of the HIV virus, more than 25 million people have been killed since the discovery of the HIV virus, based on the detection of HIV (HIV) based on magnetic separation and chemiluminescence. 2 million 700 thousand new HIV infections are reported annually. Therefore, it is very important to study a new cheap and effective HIV virus diagnosis method. This study introduces a HIV detection analysis based on DNA hybridization and chemiluminescence. The one step reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is used to amplify the HIV target sequence. The optimum annealing temperature is 58 C.B. Iotin-11-dUTP added into the one step RT-PCR amplification reaction, the magnetic beads modified by the Biotin. probe on the amplified products are used to capture these target sequences and generate the detection signals. This paper optimizes the different factors that may affect the chemiluminescence signal. Finally, the best hybridization temperature is produced at the concentration of the probe at 35 C.5 mu M. The best chemiluminescence signal. The best hybridization time is 30 minutes. This method shows a good specificity. When HCV and HBV infected serum replace HIV serum, the negative signal is obtained. The system successfully detects 10 copies of virus copy / milliliter of serum. Based on magnetic nanoparticles and chemiluminescence analysis, it extracts and detects many kinds of serum. Compared with the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) assay, the method based on nucleic acid detection is more sensitive. A variety of testing methods have been used to detect a variety of pathogens and can reduce the cost of nucleic acid detection. However, these methods can not reliably detect a large number of pathogens. In this study, a chemiluminescence detection based on DNA hybridization was established. The method, which is used to detect the number of pathogens at the same time, has no limitation on the number of pathogens. The probe has high specificity to capture virus sequences through the simultaneous extraction and detection of HBV, HCV and HIV. A single virus can be detected at the presence of higher loads in other viruses. The test can detect 10 copies / milliliters of blood. 10 copies / milliliters of HCV serum and 100 copies / milliliters of HIV serum. Based on magnetic separation technology from nucleic acid extraction to chemiluminescence detection, this method can be integrated into an automated system for convenient and high flux pathogen detection.
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446

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本文編號：2094876