本文選題：化學(xué)發(fā)光 + 胰蛋白酶�。� 參考：《天津大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：蛋白酶,是水解蛋白質(zhì)或多肽的一類酶,在許多人體生理過程中具有非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),在許多如炎癥、心血管疾病、癌癥等的病理條件下,蛋白酶活性也會發(fā)生改變。因此簡便、快速、高靈敏度的蛋白酶檢測方法在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域具有重要意義。本文發(fā)展了無標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光蛋白酶活性檢測新方法。本文由以下兩部分組成:第一部分建立了基于鏈霉親和素修飾磁珠(MB-SAs)的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光(CL)法檢測蛋白酶活性。設(shè)計了一條生物素化的多肽(bio-P1),其包含精氨酸(Arg)和一個末端半光氨酸(Cys),作為胰蛋白酶的水解底物。將bio-P1加入到堿性魯米諾(luminol)-NaIO4溶液,bio-P1末端的Cys能夠催化溶液反應(yīng)產(chǎn)生很強的CL信號。當(dāng)通過鏈霉親和素-生物素反應(yīng)將bio-P1固定在MB-SAs表面后,再加入到堿性luminol-NaIO4溶液中,溶液僅發(fā)出微弱的CL信號�；诖�,我們建立了基于CL信號恢復(fù)的CL法檢測蛋白酶活性及其抑制劑。該方法不需要洗滌或分離過程,線性范圍為0.01 nM-2 nM,檢測限為10 pM。通過檢測胰蛋白酶抑制劑,我們發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶抑制劑SBTI、PMSF和EDTA對胰蛋白酶抑制的IC50(抑制效率為50%時所對應(yīng)的的抑制劑濃度)分別為1 nM、0.01 mM和3.28 mM。另外,通過簡單的改變多肽底物,此方法能夠拓寬至其他蛋白酶的檢測。第二部分,我們設(shè)計了含有Arg和末端Cys的多肽(P),利用氧化石墨烯(GO)和luminol-NaIO4-P CL系統(tǒng),發(fā)展了無標(biāo)記的CL傳感器檢測胰蛋白酶活性及其抑制劑。該方法依據(jù)P和P-GO復(fù)合物對luminol-NaIO4 CL反應(yīng)的催化作用不同而建立。將P和luminol-NaIO4堿性溶液混合,檢測到很強的CL信號。然而,將P-GO復(fù)合物和luminol-Na IO4溶液混合,只能檢測到微弱的CL信號�；谏鲜霭l(fā)現(xiàn),我們建立了無標(biāo)記的CL法檢測胰蛋白酶活性。檢測線性范圍為0.02-10 nM,檢測限可達(dá)7.3 pM,并且能夠用于胰蛋白酶抑制劑的篩選。胰蛋白酶抑制劑SBTI和EDTA對胰蛋白酶抑制的IC50分別為0.7 nM和12 mM。通過改變多肽底物,此方法可以拓寬至其他蛋白酶的檢測。
[Abstract]:Protease is a kind of enzyme that hydrolyzes protein or polypeptide. It plays a very important role in many physiological processes of human body. Studies have found that protease activity also changes in many pathological conditions, such as inflammation, cardiovascular disease, and cancer. Therefore, simple, rapid and sensitive detection of protease is of great significance in the field of medical diagnosis. A new method for the detection of chemiluminescence protease activity without labeling was developed. This paper is composed of the following two parts: in the first part, an unlabeled chemiluminescence (CLL) method based on streptavidin modified MB-SAs) was developed for the detection of protease activity. A biotinylated polypeptide named Bio-P _ (1) containing arginine (Arg) and a terminal hemiphosminated cystatin (Cysn) was designed as a substrate for hydrolysis of trypsin. The Cys at the end of bio-P1 can catalyze the solution reaction to produce a strong CL signal. Bio-P1 was immobilized on the surface of MB-SAs by streptavidin-biotin reaction, and then added to alkaline luminol-NaIO4 solution, which only gave off a weak CL signal. Based on this, we established CL method based on CL signal recovery to detect protease activity and its inhibitors. The linear range of the method is 0.01 nm -2 nm and the detection limit is 10 pm. Through the detection of trypsin inhibitors, we found that the inhibition of trypsin inhibitor SBTIPMSF and EDTA on the inhibition of trypsin IC50 (inhibition efficiency is 50 corresponding to the inhibitor concentration) is 1 nM0. 01 mm and 3. 28 mm respectively. In addition, by simply changing the peptide substrate, the method can be extended to other protease detection. In the second part, we developed an unlabeled CL sensor for the detection of trypsin activity and its inhibitors using graphene oxide (GOO) and luminol-NaIO4-PCL systems. The method is based on the different catalytic effects of P and P-GO complexes on luminol-NaIO4CL reaction. A strong CL signal was detected by mixing P with luminol-NaIO4 alkaline solution. However, only weak CL signals could be detected by mixing P-GO complex with luminol-NaIO4 solution. Based on the above findings, we developed a non-labeled CL assay for the detection of trypsin activity. The linear range of detection was 0.02-10 nm, the detection limit was 7.3 pm, and could be used for screening trypsin inhibitors. The IC50 of trypsin inhibitor SBTI and EDTA were 0.7 nm and 12 mm respectively. By changing the peptide substrate, this method can be extended to other protease detection.
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：O657.3;R446.1

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本文編號：1997277