本文選題：造血干細(xì)胞移植 + 中樞免疫��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的造血干細(xì)胞移植(HSCT, hematopoietic stem cell transplantation)是治療惡性血液系統(tǒng)疾病及部分遺傳性疾病的有效手段。自1965年的第一例異基因骨髓移植得到成功后,HSCT在近幾十年來(lái)獲得了巨大的進(jìn)展,目前每年全球有近十萬(wàn)人次接受HSCT的治療。移植前大劑量的放化療摧毀了患者體內(nèi)正常的造血和免疫功能,保證移植的異基因造血干細(xì)胞在受者體內(nèi)分化、發(fā)育成熟并重建造血功能和免疫功能。移植后骨髓造血可以較快的重建,但免疫功能重建需要比較長(zhǎng)的時(shí)間。移植后免疫重建延遲導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能嚴(yán)重低下,患者在移植后對(duì)各種病菌的抵抗力明顯下降,容易并發(fā)感染,同時(shí)由于免疫功能重建延遲導(dǎo)致免疫監(jiān)督清除功能低下使惡性血液病容易復(fù)發(fā)�，F(xiàn)在感染和疾病復(fù)發(fā)已經(jīng)成了造血干細(xì)胞移植術(shù)后常見(jiàn)的死亡原因。移植后的免疫重建包括細(xì)胞免疫和體液免疫的重建,以細(xì)胞免疫的重建最為重要。造血干細(xì)胞移植后首先是中性粒細(xì)胞的數(shù)量恢復(fù),中性粒細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常使受者具有一定的抗感染免疫,一般恢復(fù)時(shí)間大約14-21天。接著是自然殺傷(NK,natural killer)細(xì)胞及單核細(xì)胞的數(shù)量恢復(fù),一般在移植后的14-60天可恢復(fù)至移植前的水平,NK細(xì)胞數(shù)量的正常使受者具有一定的抗病毒免疫功能,但其功能的成熟需要較長(zhǎng)時(shí)間。CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù),一般持續(xù)2-8個(gè)月,B細(xì)胞數(shù)量的正常使患者有能力產(chǎn)生抗體,但體液免疫功能恢復(fù)完全正常仍需要較長(zhǎng)時(shí)間,一般可能需要1-2年。CD4+T細(xì)胞是細(xì)胞毒的主要效應(yīng)細(xì)胞,具有抗特殊細(xì)菌感染和對(duì)突變細(xì)胞清除的免疫監(jiān)督作用。移植后CD4+數(shù)量恢復(fù)時(shí)間最慢,在人白細(xì)胞抗原(HLA)全相合移植的病人中,一般需要1-2年時(shí)間才能恢復(fù),而在單倍體相合移植模式下細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常甚至需要5年時(shí)間。T細(xì)胞免疫重建主要存在兩條路徑：(1)非胸腺依賴路徑：移植初期外周血淋巴細(xì)胞的快速增殖是來(lái)源于外周血中存在的初始T細(xì)胞及記憶T細(xì)胞,這兩類細(xì)胞主要是由移植物中供者來(lái)源的成熟T細(xì)胞,受者在經(jīng)過(guò)預(yù)處理后體內(nèi)所殘留的部分初始T細(xì)胞及記憶細(xì)胞,另外也包括移植后接受供者淋巴細(xì)胞輸注治療時(shí)所輸入的供者T細(xì)胞所構(gòu)成。但是由于這條路徑不能產(chǎn)生新生的初始T細(xì)胞,因而只能在移植初期對(duì)機(jī)體有免疫保護(hù)作用。對(duì)于一個(gè)具有完整功能的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),需要新生初始T細(xì)胞持續(xù)不斷的產(chǎn)生以及遷移至外周淋巴器官中才能很好的維持免疫功能,因而移植后T細(xì)胞免疫重建主要還是依賴胸腺途徑。(2)胸腺依賴途徑：正常生理情況下,T細(xì)胞的發(fā)育及成熟主要是在胸腺完成。骨髓中造血干細(xì)胞分化成淋巴祖細(xì)胞,然后遷移至胸腺,經(jīng)歷胸腺中陰性及陽(yáng)性選擇的成熟過(guò)程,最終成熟為對(duì)主要組織相容性復(fù)合體(MHC, major histocompatibility complex)有限制性識(shí)別能力,同時(shí)保留了對(duì)自身抗原耐受即僅能識(shí)別非己抗原的初始T淋巴細(xì)胞。一般經(jīng)過(guò)這一過(guò)程,僅只有小于5%的新生初始T淋巴細(xì)胞能夠從胸腺中輸出至外周的淋巴器官中。由此可見(jiàn),胸腺功能在T細(xì)胞免疫重建中擔(dān)當(dāng)著極其重要的角色。如何判斷T細(xì)胞重建功能是目前臨床上常遇到的問(wèn)題。流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展可以很方便的檢測(cè)T細(xì)胞亞群數(shù)量及百分比。但是流式細(xì)胞技術(shù)很難區(qū)分T細(xì)胞的來(lái)源,是來(lái)源于供者記憶T細(xì)胞增殖還是來(lái)源于中樞免疫器官即胸腺新生T細(xì)胞,目前無(wú)法通過(guò)該技術(shù)得到答案。T細(xì)胞受體刪除環(huán)(TREC,T-cell receptor excision circle)是T細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中,T細(xì)胞受體(TCR, T-cell receptor)-α基因重排時(shí)產(chǎn)生的一段環(huán)狀DNA,該環(huán)狀DNA可穩(wěn)定保存在細(xì)胞中,不會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增,因而會(huì)逐漸被稀釋,其數(shù)量可以代表?yè)碛泄δ芏鄻有訲CR基因的初始T細(xì)胞數(shù)量。TREC的拷貝數(shù)可以通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR, polymerase chain reaction)技術(shù)檢測(cè)和計(jì)算,相對(duì)客觀的的反應(yīng)胸腺近期輸出初始T細(xì)胞的數(shù)量,以此判斷體內(nèi)新生T細(xì)胞和胸腺的功能狀態(tài)。移植后中樞免疫重建的研究已有許多相關(guān)報(bào)道,許多研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理方案、移植物抗宿主病(GVHD)、GVHD預(yù)防措施、移植時(shí)的疾病狀態(tài)以及移植物來(lái)源與成份都影響移植后中樞免疫功能即新生CD4+T細(xì)胞的重建。清髓性的預(yù)處理主要影響胸腺上皮細(xì)胞的數(shù)量及功能,同時(shí)引起T淋巴祖細(xì)胞增殖、分化及遷移所需的細(xì)胞因子和趨化因子的分泌減少。在小鼠中已觀察到移植前的放療劑量會(huì)顯著損傷移植后胸腺輸出淋巴細(xì)胞的數(shù)量與質(zhì)量,這可能是大劑量的放療使得胸腺基質(zhì)細(xì)胞功能發(fā)生改變或缺失,因而細(xì)胞發(fā)育成熟所必需的細(xì)胞因子及趨化因子分泌減少,最終影響到了胸腺上皮細(xì)胞的數(shù)量及功能變化。移植后GVHD可引起胸腺的形態(tài)改變,表現(xiàn)在胸腺細(xì)胞的減少以及基質(zhì)細(xì)胞成分的改變,已有研究通過(guò)TRECs方法檢測(cè)證實(shí)GVHD能損傷胸腺的淋巴細(xì)胞輸出數(shù)量。此外GVHD也可干擾胸腺細(xì)胞的成熟,在GVHD模型小鼠上,由于胸腺上皮細(xì)胞成分及結(jié)構(gòu)的改變,使得胸腺中T細(xì)胞發(fā)育和分化選擇出現(xiàn)了障礙。自1998年,我們中心建立了清髓性FBCA預(yù)處理方案(包括氟達(dá)拉濱、白舒非、環(huán)磷酰胺及兔抗人胸腺球蛋白)聯(lián)合G-CSF動(dòng)員外周血造血干細(xì)胞的非體外去T細(xì)胞移植方案,到目前已經(jīng)治愈了很多血液疾病患者。難治復(fù)發(fā)的高危白血病患者在接受了該方案移植后5年長(zhǎng)期生存可達(dá)35%,而中�；颊�5年長(zhǎng)期生存可達(dá)60%左右。但是同樣,移植后感染和復(fù)發(fā)是移植后患者死亡的重要原因,在我們建立的方案下移植后復(fù)發(fā)率大約是20%,而移植后巨細(xì)胞病毒感染是60%左右。國(guó)內(nèi)、外不同移植中心用不同移植方案進(jìn)行了造血干細(xì)胞移植,移植后對(duì)中樞免疫重建的研究也有報(bào)道,與這些研究相比,在我們中心建立的FBCA預(yù)處理非體外去T細(xì)胞異基因造血干細(xì)胞移植模式,其免疫重建及中樞免疫的重建情況如何?中樞免疫功能與移植后感染、GVHD及復(fù)發(fā)的關(guān)系如何?尚沒(méi)有系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)與分析。本研究以我院用清髓性FBCA預(yù)處理方案接受HSCT的移植患者為研究對(duì)象,測(cè)定移植后不同時(shí)間點(diǎn)T細(xì)胞各亞群(CD3+/CD4+/CD8+)數(shù)量和TREC拷貝數(shù),并將其與年齡、移植后感染、GVHD、復(fù)發(fā)等因素進(jìn)行分析,初步探究在該清髓性FBCA預(yù)處理聯(lián)合G-CSF動(dòng)員外周造血干細(xì)胞的非體外去T細(xì)胞移植模式下,患者移植后T細(xì)胞免疫重建特別是中樞免疫重建的一般規(guī)律,以及同移植后預(yù)后因素的相關(guān)關(guān)系。研究方法1.研究對(duì)象選取2013年1月到2014年1月在我院血液科行HSCT的部分血液疾病患者。共有20例患者入組研究,中位年齡18歲(3-47歲),其中12例年齡小于20歲,8例年齡大于等于20歲,男性11例,女性9例。6例患者診斷為急性髓系白血病(AML),4例患者診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL),2例患者診斷為慢性髓系白血病(CML),5例診斷為再生障礙性貧血(SAA),2例診斷為地中海貧血,1例診斷為骨髓增生異常綜合癥(MDS)。按照危險(xiǎn)度分層,7例患者診斷為中危,13例為高危。2.造血干細(xì)胞移植患者的健康親屬作為供者選擇的來(lái)源,采用直接核苷酸序列分析(SBT, Sequenceing-based typing,高分辨分型)以及微量序列特異引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP, sequence-specific primers PCR,中分辨分型)技術(shù)進(jìn)行供受者HLA配型,選擇高分辨分型至少5個(gè)位點(diǎn)以上或者中分辨分型至少3個(gè)位點(diǎn)以上相合的親屬作為供者。20例患者均采用我們建立的FBCA預(yù)處理方案：氟達(dá)拉濱Flu 30mg/m2(-9至-5d)；白舒非BU 0.8mg/kg/q6h(-8至-5d)；環(huán)磷酰胺CY60mg/kg(-3至-2d)；兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白ATG,全相合移植患者1.25mg/kg/d(-3至-1d),單倍體相合患者2.5 mg/kg/d(-5至-1d)。移植物采用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF, granulocyte colony-stimulating factor)動(dòng)員的外周血干細(xì)胞,不做體外去T細(xì)胞處理。GVHD的預(yù)防措施包括常規(guī)的環(huán)孢素(CsA,3mg/kg/d)以及甲氨蝶呤(MTX,15mg/m2+1d,10mg/m2+3/+6/+11d)的應(yīng)用,環(huán)孢素一般在移植后180天逐漸減量停用。在輸注干細(xì)胞后每日使用G-CSF以及重組人血小板生成素(rhTPO, Recombinant human-thrombopoietin)等直至造血重建的恢復(fù)。3. T細(xì)胞亞群數(shù)量檢測(cè)采集患者在移植后+1月、+3月、+6月以及+12月的外周血,采用流式細(xì)胞術(shù)分析的方法,監(jiān)測(cè)移植后+1月、±3月、±6月以及+12月患者外周血中CD3+、 CD4+及CD8+T細(xì)胞亞群的數(shù)量,了解患者外周的T細(xì)胞免疫狀態(tài)。4. 外周血TREC水平的監(jiān)測(cè)采集患者移植后+1月、+3月、+6月以及+12月的外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC, peripheral blood mononuclear cell),用試劑盒提取基因組DNA。采用文獻(xiàn)中報(bào)道的引物(暨南大學(xué)血液病研究所李揚(yáng)秋教授贈(zèng)送),采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)患者外周血中100000個(gè)PBMNCs中TREC的拷貝數(shù),評(píng)估患者的胸腺近期輸出T細(xì)胞功能。5. 移植后相關(guān)因素與免疫重建的關(guān)系將患者移植后外周血T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)以及TREC拷貝數(shù),采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)、TREC及同移植后相關(guān)因素(包括年齡、感染、GVHD、復(fù)發(fā))的關(guān)系,雙邊檢驗(yàn)P值小于0.05為有顯著意義。結(jié)果1.在我院清髓性FBCA預(yù)處理的HSCT后,20例進(jìn)入研究統(tǒng)計(jì)。20例患者移植后均造血重建,STR-PCR檢測(cè)均為供者細(xì)胞完全植入。中性粒細(xì)胞植入的中位時(shí)間為13天(11-18天),血小板植入的中位時(shí)間為14天(%20天)。移植后100天內(nèi)發(fā)生急性GVHD (aGVHD, acute graft-versus-host disease)的發(fā)生率為35%,aGVHDⅠ度的患者6例,aGVHD Ⅱ度的患者1例,沒(méi)有嚴(yán)重aGVHD的發(fā)生。移植后慢性GVHD (cGVHD, chronic graft-versus-host disease)的發(fā)生率為15%,3例患者出現(xiàn)局限性的cGVHD。4例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā),本組病人的復(fù)發(fā)率為20%。20例患者中只有1例死亡,死亡原因?yàn)閺?fù)發(fā)及肝臟、腸道Ⅳ度GVHD。2.所有患者在移植后1個(gè)月外周血CD3±細(xì)胞數(shù)339.72±69.79/μL,移植后3個(gè)月CD3+細(xì)胞數(shù)上升至405.88±85.68/μL,到6個(gè)月時(shí)細(xì)胞數(shù)上升為810.05±208.11/μL,在移植后12個(gè)月時(shí)為1207.99±250.72/μL; CD4+細(xì)胞在移植后1個(gè)月為細(xì)胞數(shù)138.98±41.96/μL,移植后3個(gè)月CD4+細(xì)胞數(shù)下降至126.50±17.02/μL,到6個(gè)月時(shí)細(xì)胞數(shù)上升為228.91±66.95/μL,在移植后12個(gè)月時(shí)為358.14±195.46/μL：CD8+細(xì)胞數(shù)在移植后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月以及12個(gè)月時(shí)分別為255.63±47.23/μL、371.91±62.69/μL、775.82±73.26/μL及971.87±138.56/μL。3.20例患者移植后1個(gè)月外周血TREC拷貝數(shù)為0.93±2.45拷貝/105細(xì)胞,3個(gè)月時(shí)為7.56±7.64拷貝/105細(xì)胞,6個(gè)月及12個(gè)月分別為85.83±54.80拷貝/105細(xì)胞和148.62±77.61拷貝/105細(xì)胞。與正常人相比,20例患者移植后不同時(shí)間外周血TREC拷貝數(shù)均低于正常人群,但隨移植時(shí)間的延長(zhǎng),TREC數(shù)量增加,表明中樞免疫功能的重建隨移植后時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸恢復(fù),與CD4+T細(xì)胞比較TREC恢復(fù)更慢。4.進(jìn)一步分析表明,年齡對(duì)免疫功能的重建有一定影響。年齡≥20歲患者在移植后不同時(shí)間外周T細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)均低于年齡20歲患者,尤其是在移植后6個(gè)月以及12個(gè)月的CD4+細(xì)胞數(shù)上是有顯著性差異(P值分別為0.028以及0.0001)。而反映中樞免疫功能重建的TREC拷貝數(shù),年齡20歲患者在移植后6個(gè)月及12個(gè)月的TREC拷貝數(shù)也明顯低于年齡20歲組的病人(P值分別為0.012以及0.002)。這些結(jié)果提示無(wú)論是外周T細(xì)胞還是反映中樞免疫功能的TREC,年輕患者更容易在移植后重建。5.移植后感染與移植后免疫功能狀態(tài)有非常密切的關(guān)系,中樞免疫重建延遲與移植后遲發(fā)霉菌感染有關(guān)。20例患者移植后17例病人出現(xiàn)不同程度的感染。其中年齡20歲組移植后6個(gè)月內(nèi),12例出現(xiàn)EB病毒感染,13例CMV感染,,3例出血性膀胱炎,2例單純皰疹病毒感染,1例肺部霉菌性感染,而年齡≥20歲組移植6個(gè)月內(nèi),5例出現(xiàn)EB病毒感染,5例CMV感染,4例出血性膀胱炎,1例單純皰疹病毒感染,1例肺部霉菌性感染。移植6個(gè)月后,年齡20歲組只有1例出現(xiàn)肺部霉菌感染,而年齡≥20歲組出現(xiàn)5例肺部霉菌感染,1例單純皰疹病毒。移植6個(gè)月后發(fā)生霉菌感染的患者在移植后12個(gè)月CD4+T細(xì)胞數(shù)及低于未發(fā)生霉菌感染的人(P值為0.046),而且移植后6個(gè)月及12個(gè)月的TREC拷貝數(shù)平均水平也要低于未發(fā)生感染的患者(P值分別為0.044及0.003)。無(wú)論是aGVHD、cGVHD或復(fù)發(fā)患者,與未發(fā)生該事件的患者相比兩者移植后T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)及TREC拷貝數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。結(jié)論1.在我們建立的FBCA預(yù)處理及G-CSF動(dòng)員外周血干細(xì)胞的非體外去T細(xì)胞移植方案下,患者在移植后的免疫重建需要較長(zhǎng)時(shí)間,移植后1年中樞免疫功能尚未恢復(fù)正常,與國(guó)內(nèi)外類似研究結(jié)果是相似的。2.年齡是影響移植后中樞免疫重建的重要因素,中樞免疫功能的重建低下與移植后遲發(fā)霉菌感染相關(guān)。年齡20歲組移植后T細(xì)胞重建快于年齡≥20歲組,年齡20歲的患者在移植后期發(fā)生霉菌感染次數(shù)明顯少于年齡≥20歲組的患者,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)發(fā)生霉菌感染的患者T細(xì)胞重建慢于未發(fā)生霉菌感染者,這提示移植后年齡20歲組在移植遠(yuǎn)期較少的感染可能同年輕患者胸腺功能較好,T細(xì)胞免疫恢復(fù)快有關(guān)。3.接受異基因造血干細(xì)胞移植的患者在移植后胸腺近期輸出功能低于正常人水平。而移植后胸腺近期輸出功能同移植后中樞免疫重建密切相關(guān),促進(jìn)及改善移植后胸腺功能也許可能是克服移植后免疫重建延遲的途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R457.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1995175