本文選題：肺癌 + 免疫基因治療�。� 參考：《四川醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景與目的:肺癌已經(jīng)成為對(duì)人類生命和健康威脅最大的頭號(hào)癌癥殺手,盡管過去的數(shù)十年間,手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)治療不斷取得進(jìn)展,但目前肺癌的治療效果仍不理想。免疫基因治療是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一,也是有望改善目前肺癌治療現(xiàn)狀的新方法而備受期待。引入外源性抗原基因,使腫瘤細(xì)胞表達(dá)外源性抗原,激活宿主的主動(dòng)免疫,是免疫基因治療的重要策略。多項(xiàng)研究展示了這種方法的可行性。然而,機(jī)體的免疫機(jī)制十分復(fù)雜,過度或廣泛的免疫反應(yīng)將導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫相關(guān)性疾病。因此,腫瘤免疫基因治療理想結(jié)果應(yīng)該是治療效應(yīng)具有高度腫瘤靶向性,即免疫反應(yīng)局限在腫瘤局部。用腫瘤特異性啟動(dòng)子對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控是靶向性基因治療的基本方法之一。端粒酶催化亞單位(telomerase catalytic subunit,TERT)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性具有腫瘤特異性高,適用范圍廣泛的特點(diǎn),成為腫瘤靶向性基因治療研究中應(yīng)用最廣泛的的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本課題旨在探索以小鼠TERT啟動(dòng)子作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,以結(jié)核桿菌抗原基因Ag85A和Ag85B為治療基因的肺癌靶向性免疫基因治療的可行性和具體途徑。方法:1.小鼠基因組DNA為模板,通過PCR方法克隆小鼠端粒酶催化亞單位啟動(dòng)子(mTERTp)活性片段,并將mTERT啟動(dòng)子插入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-basic,構(gòu)建mTERTp調(diào)控的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-mTERTp,然后用 Luciferase Assay 檢測(cè) mTERTp 在小鼠 Lewis 肺癌細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人食管癌細(xì)胞株EC-109和正常人胚肺成纖維細(xì)MRC-5中的轉(zhuǎn)錄活性;2.化學(xué)合成結(jié)核桿菌抗原Ag85A和Ag85B雙基因序列Ag85A-MYC-P2A-Ag85B-HA,其中Myc和HA為標(biāo)簽序列,便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)Ag85A和Ag85B蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);P2A為口蹄疫病毒連接序列,將Ag85A和Ag85B連接起來,構(gòu)建到同一載體中,各自獨(dú)立表達(dá)。將Ag85A-MYC-P2A-Ag85B-HA序列克隆到慢病毒質(zhì)粒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro中,構(gòu)建成CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Ag85A-Ag85B慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV;利用核酸分子克隆技術(shù)用mTERTp取代pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV中的CMV啟動(dòng)子,構(gòu)建mTERTp驅(qū)動(dòng)的Ag85A-Ag85B雙基因慢病毒質(zhì)粒pLVX-Ag85A-MYC-Ag85B-mTERTp;3.用構(gòu)建的兩種 Ag85A-Ag85B 慢病毒質(zhì)粒分別包裝慢病毒,感染Lewis肺癌細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3,用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中Ag85A和Ag85B的表達(dá)情況;4.用卡介苗接種C57BL/6小鼠,3周后將Lewis肺癌細(xì)胞接種到C57BL/6小鼠皮下(2×106細(xì)胞/只),1周后將荷瘤小鼠隨即分成7組,每組7只,經(jīng)尾靜脈注射Ag85A-Ag85B慢病毒,觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果:1.本研究克隆的mTERT啟動(dòng)子長(zhǎng)度331bp,其序列和GeneBank中mTERT基因序列完全一致,在Lewis肺癌細(xì)胞、人肺腺癌細(xì)胞A549和食管癌細(xì)胞EC-109中均有轉(zhuǎn)錄活性,在小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3和正常人胚肺成纖維細(xì)MRC-5中無轉(zhuǎn)錄活性;2.酶切反應(yīng)和DNA測(cè)序結(jié)果顯示,CMV啟動(dòng)子和mTERTp驅(qū)動(dòng)的Ag85A-Ag85B基因慢病毒表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,Western blot結(jié)果提示在感染pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV 和 pLVX-Ag85A-Ag85B-mTERTp 的 Lewis細(xì)胞均有Ag85A和Ag85B表達(dá);感染pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV的小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞有Ag85A和Ag85B表達(dá),感染pLVX-Ag85A-Ag85B-mTERTp 的 NIH3T3 細(xì)胞無 Ag85A 和 Ag85B 表達(dá);3.接種卡介苗的Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠,注射pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV和pLVX-Ag85A-Ag85B-mTERTp慢病毒并未獲得明顯抑瘤效應(yīng)。結(jié)論:1.小鼠TERT啟動(dòng)子具有腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄活性;2.小鼠TERT啟動(dòng)子可以作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,驅(qū)動(dòng)Ag85A和Ag85B雙基因在腫瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá);3.尾靜脈注射本研究中構(gòu)建的Ag85A和Ag85B慢病毒未能對(duì)經(jīng)卡介苗免疫的Lewis肺癌荷瘤小鼠產(chǎn)生治療作用,其原因尚待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:The research background and purpose : lung cancer has become one of the most important cancer killers threatening human life and health , but it is not ideal for the treatment of lung cancer . The expression of Ag85A - Ag85B - Ag85B - CMV and pLVX - Ag85A - Ag85B - mTERTp in mice infected with pLVX - Ag85A - Ag85B - CMV and pLVX - Ag85A - Ag85B - mTERTp were detected by Western blot .
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2;R450

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本文編號(hào)：1987745