本文選題：中性微泡 + 陽離子微泡��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡制備及性能檢測第一節(jié) 中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡制備及基本物理特征檢測目的構建中性微泡(NMB)、陽離子微泡(CMB)及靶向陽離子微泡(CMB105),并檢測其基本物理特征。方法采用機械震蕩法構建三種不同脂質微泡,通過在成膜材料中加入DC-膽固醇(DC-cholesterol)使微泡表面帶正電荷從而構建陽離子微泡(CMB),通過“生物素-親和素”橋接法構建攜抗CD105抗體的靶向陽離子微泡(CMB105),并同時構建攜同型對照抗體微泡(C-CMB105),光鏡下觀察不同微泡基本形態(tài),激光共聚焦顯微鏡證實抗體連接,并檢測其濃度、粒徑和表面電位等基本特性。健康裸鼠尾靜脈注射不同類型微泡,檢測其體內循環(huán)特征。結果NMB、CMB、CMB105及C-CMB105均成功構建,光鏡下大小均一,分散度較好,激光共聚焦顯微鏡下鏈接經FITC標記二抗后的CMB105及C-CMB105顯綠色熒光；CMB和CMB105的表面電位分別為26.44±2.13和26.62±2.48 mV,而NMB表面電位為-2.38±0.56mV,呈微弱負電荷。CMB, C-CMB105和CMB105的半衰期分別為8.35±1.27,7.63±1.61和7.27±1.33 min,而NMB的半衰期長于20min。結論NMB、CMB及CMB 105構建成功,表面連接抗體并不影響微泡表面電位及粒徑。CMB和CMB105由于其表面帶正電荷,體內半衰期時間短于NMB。第二節(jié)中性微泡、陽離子微泡、靶向陽離子微泡體外及體內靶向能力檢測目的檢測NMB、CMB、及CMB105體外及體內靶向表達CD105抗原的血管內皮細胞的能力。方法第一部分采用自行設計的特殊裝置,將生長有臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的玻片先倒置與微泡充分孵育,再將其正置,倒置顯微鏡下計數(shù)與HUVECs靶向結合微泡數(shù),檢測不同微泡體外靶向的能力。第二部分皮下注射乳腺癌MDA-MB-231細胞株,建立人乳腺癌裸鼠模型,病理切片證實CD105表達于腫瘤新生血管內皮細胞。不同類型微泡經尾靜脈注射,通過超聲腫瘤成像,檢測其體內靶向腫瘤新生血管能力。兩部分實驗中,C-CMB105作為CMB105同型對照而納入實驗分組中,競爭抑制實驗被用于證實CMB105與靶細胞的特異性結合。結果體外實驗中,除NMB之外,CMB、CMB105及C-CMB105均可與表達CD105抗原的HUVECs結合,而CMB105與HUVECs靶向結合數(shù)量最高(P0.01),預先加入CD105抗體孵育后,CMB 105靶向細胞數(shù)目明顯降低(P0.01),而預先與同型對照抗體孵育時卻沒有影響(P0.05)。體內實驗中,除CMB105之外,NMB、CMB及C-CMB105均不能靶向表達CD105抗原的腫瘤新生血管內皮細胞。預先靜脈注射抗CD105抗體后,與腫瘤新生血管內皮細胞靶向結合的CMB105顯著降低(P0.001)結論CMB、CMB105及C-CMB105均可與表達CD105抗原的HUVECs結合,但只有CMB105能與HUVECs靶向結合,而CMB與C-CMB105與HUVECs結合是通過細胞與帶正電荷的微泡之間的電偶配對作用,這一優(yōu)勢在體內實驗中不復存在,充分證實了CMB105主動靶向的能力。第二部分中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡體外轉染HUVECs實驗研究第一節(jié)中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡基因攜載能力及超聲轉染后對HUVECs活性影響實驗研究目的研究NMB、CMB、CMB105攜載內皮抑素質粒(ES-GFP)能力及超聲作用后對HUVECs活性影響。方法第一部分擴增抽提內皮抑素質粒(ES-GFP)并鑒定,將不同量(10,20,40, and 80μg)的質粒與微泡(5×108個)進行孵育,利用靜電吸附原理使其充分結合,15分鐘后離心洗滌,通過檢測未結合的質粒量來計算與微泡結合的質粒量,并得出不同微泡質粒攜載能力。第二部分是在超聲作用下破壞NMB、CMB、CMB105,設空白組作為對照,通過FDA/PI雙染色即時觀察對細胞膜通透性影響,均為陽性則表示細胞膜通透性打開而同時細胞活性未受影響,并進一步行MTT檢測,觀察對細胞增殖活性影響。結果NMB、CMB、CMB105攜載ES-GFP的能力分別是0.48±0.04μg,18.21±1.22μg和16.76±1.75 μg (per 5×108 microbubbles), CMB和CMB105的基因攜載量無統(tǒng)計學差異(P0.05)。FDA+/PI+陽性率在CMB105組最高(36.89±4.28%),與空白組(0.121±0.013%)、NMB組(6.19±2.35%)和CMB組(28.12±3.58%)相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)�？瞻捉M、NMB組、CMB組、CMB105組各組細胞增殖活性分別為92.45±2.74%,90.63±2.52%,84.29±5.07%,77.38±5.33%,CMB組、CMB105組細胞增殖活性降低,組間比較差異亦具統(tǒng)計學意義。結論 由于表面帶正電荷,CMB和CMB105基因攜載能力明顯提高,而表面攜帶抗體并不影響CMB105基因攜載能力；與細胞結合微泡數(shù)量越多,其細胞膜通透性增加愈明顯,而同時細胞增殖活性降低。第二節(jié)中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡攜內皮抑素質粒超聲作用下轉染HUVECs的實驗研究目的研究NMB、CMB、CMB105攜內皮抑素質粒在超聲作用下轉染HUVECs細胞轉染效率,以及對細胞周期、體外血管成型及腫瘤細胞侵襲的影響。方法實驗分空白組、NMB組、CMB組、CMB105組四組,超聲(1 MHz, 1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下轉染HUVECs,轉染后收集細胞行流式細胞檢測轉染效率及細胞周期,qPCR及Western-blot分別檢測Endostatin、VEGF、Caspase-3 mRNA及蛋白表達情況。通過體外血管成型及MDA-MB-231細胞侵襲評價ES質粒在不同微泡介導轉染后治療效果。結果轉染后24小時各組轉染效率分別為0.22±0.02%,1.36±0.13%,22.87±1.64%,33.60±2.02%,各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)；轉染后24小時即可觀察到在CMB和CMB105組,細胞周期抑制于G1期,48小時細胞周期抑制更加明顯,CMB和CMB105組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01); qPCR和Western-blot均檢測到在CMB和CMB105組Endostatin和Caspase-3 mRNA及蛋白表達增加,而VEGF mRNA及蛋白表達下降,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在血管成型及腫瘤細胞侵襲實驗中,各組血管官腔形成數(shù)目分別為：22.33±3.082、21.05±3.120、14.33±2.150、6.33±2.520,遷移腫瘤細胞數(shù)目分別為：67.33±5.06、64.72±5.38、34.33±3.22、25.17±2.84。結論CMB和CMB105組較對照組和NMB組轉染效率明顯提高,但CMB105組具有更高的轉染效率及生物學效應,可明顯抑制體外血管成型以及腫瘤細胞侵襲。第三部分中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡轉染治療乳腺癌種植瘤實驗研究目的研究NMB、CMB、CMB105攜ES質粒在超聲作用下轉染MDA-MB-231細胞裸鼠種植瘤,觀察其對腫瘤模型生長的影響及治療作用。方法雙后肢皮下注射MDA-MB-231細胞懸液建立種植瘤模型,造模后14天,NMB、CMB、CMB105攜ES質粒在超聲(1 MHz,2 W/cm2, and 50% DC,30 seconds)作用下轉染腫瘤,左側腫瘤接受治療,右側腫瘤做為對照。治療前及治療后每3天觀察記錄腫瘤生長情況,治療后15天處死動物,剝取腫瘤計算抑瘤率,行TUNEL及PCNA觀察腫瘤細胞凋亡及增殖狀況。結果通過繪制腫瘤生長曲線,在轉染后12天開始,CMB治療組及CMB105治療組腫瘤生長均受到抑制,轉染后15天,NMB、CMB及CMB105各治療組抑瘤率分別為：10.63±1.47%、27.57±3.02%、53.18±5.69%,CMB105攜帶ES質粒在超聲作用下成功抑制腫瘤生長。三組的凋亡指數(shù)分別為：8.217±3.628%、25.06±5.721%、56.643士8.534%,增殖指數(shù)分別為：78.353±8.726%、50.98±6.142%、21.873±4.309%。結論攜載ES質粒的CMB105在超聲作用下其抗腫瘤治療效應明顯優(yōu)于CMB及NMB,可在一定程度上延緩腫瘤生長。
[Abstract]:Three kinds of lipid vesicles were prepared by means of mechanical shock method . The results showed that the cells were successfully constructed by adding DC - cholesterol to the membrane - forming material , and the circulating characteristics of the cells were detected . Results NMB , CMB , CMB105 and C - CMB105 were successfully constructed .
In vitro and in vivo experiments , in vitro and in vivo , CMB , CMB105 and C - CMB105 were able to target tumor angiogenesis in vitro and in vivo . In vivo experiments , both CMB , CMB105 and C - CMB105 were able to target tumor neovascularization . Results NMB , CMB and CMB105 were the highest in CMB105 group ( 36.89 鹵 4.28 % ) .
In vitro angiogenesis and MDA - MB - 231 cell invasion , the efficiency of transfection and cell cycle , qPCR and Western - blot were used to investigate the effects of the transfection efficiency and cell cycle , qPCR and Western - blot on the expression of Endostatin , VEGF , Caspase - 3 mRNA and protein .
In the experiment of angiogenesis and tumor cell invasion , the tumor growth was significantly increased in both CMB and CMB105 groups . The results showed that the tumor growth was significantly increased in both CMB and CMB105 groups .
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R450

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本文編號：1977298