本文選題：中性微泡 + 陽(yáng)離子微泡　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分中性微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡制備及性能檢測(cè)第一節(jié) 中性微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡制備及基本物理特征檢測(cè)目的構(gòu)建中性微泡(NMB)、陽(yáng)離子微泡(CMB)及靶向陽(yáng)離子微泡(CMB105),并檢測(cè)其基本物理特征。方法采用機(jī)械震蕩法構(gòu)建三種不同脂質(zhì)微泡,通過(guò)在成膜材料中加入DC-膽固醇(DC-cholesterol)使微泡表面帶正電荷從而構(gòu)建陽(yáng)離子微泡(CMB),通過(guò)“生物素-親和素”橋接法構(gòu)建攜抗CD105抗體的靶向陽(yáng)離子微泡(CMB105),并同時(shí)構(gòu)建攜同型對(duì)照抗體微泡(C-CMB105),光鏡下觀察不同微泡基本形態(tài),激光共聚焦顯微鏡證實(shí)抗體連接,并檢測(cè)其濃度、粒徑和表面電位等基本特性。健康裸鼠尾靜脈注射不同類型微泡,檢測(cè)其體內(nèi)循環(huán)特征。結(jié)果NMB、CMB、CMB105及C-CMB105均成功構(gòu)建,光鏡下大小均一,分散度較好,激光共聚焦顯微鏡下鏈接經(jīng)FITC標(biāo)記二抗后的CMB105及C-CMB105顯綠色熒光；CMB和CMB105的表面電位分別為26.44±2.13和26.62±2.48 mV,而NMB表面電位為-2.38±0.56mV,呈微弱負(fù)電荷。CMB, C-CMB105和CMB105的半衰期分別為8.35±1.27,7.63±1.61和7.27±1.33 min,而NMB的半衰期長(zhǎng)于20min。結(jié)論NMB、CMB及CMB 105構(gòu)建成功,表面連接抗體并不影響微泡表面電位及粒徑。CMB和CMB105由于其表面帶正電荷,體內(nèi)半衰期時(shí)間短于NMB。第二節(jié)中性微泡、陽(yáng)離子微泡、靶向陽(yáng)離子微泡體外及體內(nèi)靶向能力檢測(cè)目的檢測(cè)NMB、CMB、及CMB105體外及體內(nèi)靶向表達(dá)CD105抗原的血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力。方法第一部分采用自行設(shè)計(jì)的特殊裝置,將生長(zhǎng)有臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的玻片先倒置與微泡充分孵育,再將其正置,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)與HUVECs靶向結(jié)合微泡數(shù),檢測(cè)不同微泡體外靶向的能力。第二部分皮下注射乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株,建立人乳腺癌裸鼠模型,病理切片證實(shí)CD105表達(dá)于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。不同類型微泡經(jīng)尾靜脈注射,通過(guò)超聲腫瘤成像,檢測(cè)其體內(nèi)靶向腫瘤新生血管能力。兩部分實(shí)驗(yàn)中,C-CMB105作為CMB105同型對(duì)照而納入實(shí)驗(yàn)分組中,競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)被用于證實(shí)CMB105與靶細(xì)胞的特異性結(jié)合。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)中,除NMB之外,CMB、CMB105及C-CMB105均可與表達(dá)CD105抗原的HUVECs結(jié)合,而CMB105與HUVECs靶向結(jié)合數(shù)量最高(P0.01),預(yù)先加入CD105抗體孵育后,CMB 105靶向細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P0.01),而預(yù)先與同型對(duì)照抗體孵育時(shí)卻沒(méi)有影響(P0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,除CMB105之外,NMB、CMB及C-CMB105均不能靶向表達(dá)CD105抗原的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。預(yù)先靜脈注射抗CD105抗體后,與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向結(jié)合的CMB105顯著降低(P0.001)結(jié)論CMB、CMB105及C-CMB105均可與表達(dá)CD105抗原的HUVECs結(jié)合,但只有CMB105能與HUVECs靶向結(jié)合,而CMB與C-CMB105與HUVECs結(jié)合是通過(guò)細(xì)胞與帶正電荷的微泡之間的電偶配對(duì)作用,這一優(yōu)勢(shì)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不復(fù)存在,充分證實(shí)了CMB105主動(dòng)靶向的能力。第二部分中性微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡體外轉(zhuǎn)染HUVECs實(shí)驗(yàn)研究第一節(jié)中性微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡基因攜載能力及超聲轉(zhuǎn)染后對(duì)HUVECs活性影響實(shí)驗(yàn)研究目的研究NMB、CMB、CMB105攜載內(nèi)皮抑素質(zhì)粒(ES-GFP)能力及超聲作用后對(duì)HUVECs活性影響。方法第一部分?jǐn)U增抽提內(nèi)皮抑素質(zhì)粒(ES-GFP)并鑒定,將不同量(10,20,40, and 80μg)的質(zhì)粒與微泡(5×108個(gè))進(jìn)行孵育,利用靜電吸附原理使其充分結(jié)合,15分鐘后離心洗滌,通過(guò)檢測(cè)未結(jié)合的質(zhì)粒量來(lái)計(jì)算與微泡結(jié)合的質(zhì)粒量,并得出不同微泡質(zhì)粒攜載能力。第二部分是在超聲作用下破壞NMB、CMB、CMB105,設(shè)空白組作為對(duì)照,通過(guò)FDA/PI雙染色即時(shí)觀察對(duì)細(xì)胞膜通透性影響,均為陽(yáng)性則表示細(xì)胞膜通透性打開而同時(shí)細(xì)胞活性未受影響,并進(jìn)一步行MTT檢測(cè),觀察對(duì)細(xì)胞增殖活性影響。結(jié)果NMB、CMB、CMB105攜載ES-GFP的能力分別是0.48±0.04μg,18.21±1.22μg和16.76±1.75 μg (per 5×108 microbubbles), CMB和CMB105的基因攜載量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。FDA+/PI+陽(yáng)性率在CMB105組最高(36.89±4.28%),與空白組(0.121±0.013%)、NMB組(6.19±2.35%)和CMB組(28.12±3.58%)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)�？瞻捉M、NMB組、CMB組、CMB105組各組細(xì)胞增殖活性分別為92.45±2.74%,90.63±2.52%,84.29±5.07%,77.38±5.33%,CMB組、CMB105組細(xì)胞增殖活性降低,組間比較差異亦具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 由于表面帶正電荷,CMB和CMB105基因攜載能力明顯提高,而表面攜帶抗體并不影響CMB105基因攜載能力；與細(xì)胞結(jié)合微泡數(shù)量越多,其細(xì)胞膜通透性增加愈明顯,而同時(shí)細(xì)胞增殖活性降低。第二節(jié)中性微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡攜內(nèi)皮抑素質(zhì)粒超聲作用下轉(zhuǎn)染HUVECs的實(shí)驗(yàn)研究目的研究NMB、CMB、CMB105攜內(nèi)皮抑素質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,以及對(duì)細(xì)胞周期、體外血管成型及腫瘤細(xì)胞侵襲的影響。方法實(shí)驗(yàn)分空白組、NMB組、CMB組、CMB105組四組,超聲(1 MHz, 1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下轉(zhuǎn)染HUVECs,轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞行流式細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞周期,qPCR及Western-blot分別檢測(cè)Endostatin、VEGF、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)情況。通過(guò)體外血管成型及MDA-MB-231細(xì)胞侵襲評(píng)價(jià)ES質(zhì)粒在不同微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后治療效果。結(jié)果轉(zhuǎn)染后24小時(shí)各組轉(zhuǎn)染效率分別為0.22±0.02%,1.36±0.13%,22.87±1.64%,33.60±2.02%,各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；轉(zhuǎn)染后24小時(shí)即可觀察到在CMB和CMB105組,細(xì)胞周期抑制于G1期,48小時(shí)細(xì)胞周期抑制更加明顯,CMB和CMB105組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01); qPCR和Western-blot均檢測(cè)到在CMB和CMB105組Endostatin和Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)增加,而VEGF mRNA及蛋白表達(dá)下降,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在血管成型及腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中,各組血管官腔形成數(shù)目分別為：22.33±3.082、21.05±3.120、14.33±2.150、6.33±2.520,遷移腫瘤細(xì)胞數(shù)目分別為：67.33±5.06、64.72±5.38、34.33±3.22、25.17±2.84。結(jié)論CMB和CMB105組較對(duì)照組和NMB組轉(zhuǎn)染效率明顯提高,但CMB105組具有更高的轉(zhuǎn)染效率及生物學(xué)效應(yīng),可明顯抑制體外血管成型以及腫瘤細(xì)胞侵襲。第三部分中性微泡、陽(yáng)離子微泡及靶向陽(yáng)離子微泡轉(zhuǎn)染治療乳腺癌種植瘤實(shí)驗(yàn)研究目的研究NMB、CMB、CMB105攜ES質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠種植瘤,觀察其對(duì)腫瘤模型生長(zhǎng)的影響及治療作用。方法雙后肢皮下注射MDA-MB-231細(xì)胞懸液建立種植瘤模型,造模后14天,NMB、CMB、CMB105攜ES質(zhì)粒在超聲(1 MHz,2 W/cm2, and 50% DC,30 seconds)作用下轉(zhuǎn)染腫瘤,左側(cè)腫瘤接受治療,右側(cè)腫瘤做為對(duì)照。治療前及治療后每3天觀察記錄腫瘤生長(zhǎng)情況,治療后15天處死動(dòng)物,剝?nèi)∧[瘤計(jì)算抑瘤率,行TUNEL及PCNA觀察腫瘤細(xì)胞凋亡及增殖狀況。結(jié)果通過(guò)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,在轉(zhuǎn)染后12天開始,CMB治療組及CMB105治療組腫瘤生長(zhǎng)均受到抑制,轉(zhuǎn)染后15天,NMB、CMB及CMB105各治療組抑瘤率分別為：10.63±1.47%、27.57±3.02%、53.18±5.69%,CMB105攜帶ES質(zhì)粒在超聲作用下成功抑制腫瘤生長(zhǎng)。三組的凋亡指數(shù)分別為：8.217±3.628%、25.06±5.721%、56.643士8.534%,增殖指數(shù)分別為：78.353±8.726%、50.98±6.142%、21.873±4.309%。結(jié)論攜載ES質(zhì)粒的CMB105在超聲作用下其抗腫瘤治療效應(yīng)明顯優(yōu)于CMB及NMB,可在一定程度上延緩腫瘤生長(zhǎng)。
[Abstract]:Three kinds of lipid vesicles were prepared by means of mechanical shock method . The results showed that the cells were successfully constructed by adding DC - cholesterol to the membrane - forming material , and the circulating characteristics of the cells were detected . Results NMB , CMB , CMB105 and C - CMB105 were successfully constructed .
In vitro and in vivo experiments , in vitro and in vivo , CMB , CMB105 and C - CMB105 were able to target tumor angiogenesis in vitro and in vivo . In vivo experiments , both CMB , CMB105 and C - CMB105 were able to target tumor neovascularization . Results NMB , CMB and CMB105 were the highest in CMB105 group ( 36.89 鹵 4.28 % ) .
In vitro angiogenesis and MDA - MB - 231 cell invasion , the efficiency of transfection and cell cycle , qPCR and Western - blot were used to investigate the effects of the transfection efficiency and cell cycle , qPCR and Western - blot on the expression of Endostatin , VEGF , Caspase - 3 mRNA and protein .
In the experiment of angiogenesis and tumor cell invasion , the tumor growth was significantly increased in both CMB and CMB105 groups . The results showed that the tumor growth was significantly increased in both CMB and CMB105 groups .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R450

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本文編號(hào)：1977298