本文選題：微/納制造 + 微流控芯片　； 參考：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：微/納制造主要研究特征尺寸在微米、納米范圍的功能結(jié)構(gòu)、器件與系統(tǒng)在設(shè)計(jì)、制造中的科學(xué)問題,是衡量國(guó)家制造水平的標(biāo)志之一,代表著目前制造科學(xué)的最前沿。細(xì)胞是生命結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,活體單細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)是細(xì)胞生命分析技術(shù)的極限狀態(tài),對(duì)于揭示重大疾病發(fā)生與演進(jìn)機(jī)理、促進(jìn)新型藥物研發(fā)等具有重要意義,正在成為基礎(chǔ)生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的國(guó)際前沿課題。本文將微/納制造技術(shù)與單細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)合,研制出微流控芯片系統(tǒng)使常規(guī)生化試驗(yàn)的多步驟操作全部集成微縮到單塊芯片,實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)低豐度mRNA樣本的萃取、擴(kuò)增與檢測(cè),主要研究?jī)?nèi)容有以下幾個(gè)方面。設(shè)計(jì)布局清晰、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操縱更靈活的兩類芯片微系統(tǒng),即單工作單元式和微流控陣列式芯片。前者利于實(shí)現(xiàn)便攜操作和分析,后者提高了檢測(cè)效率和通量。兩類芯片均為多層結(jié)構(gòu),包含微流動(dòng)層、控制層、薄膜夾層和含加熱器的微傳感器,在加工中改進(jìn)同類芯片工藝,解決了工程實(shí)際中PDMS薄膜局部粘附、熱循環(huán)反應(yīng)試劑蒸發(fā)和傳感器復(fù)用性等問題。此外,基于固體、流體傳熱學(xué)理論,借助通用商業(yè)軟件對(duì)芯片含加熱器的微傳感器進(jìn)行建模與仿真研究,評(píng)估該設(shè)計(jì)的溫控性能。研發(fā)試驗(yàn)系統(tǒng)平臺(tái),共包含4個(gè)部分,即微流控平臺(tái)、溫度控制平臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)平臺(tái)和生物信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)。其中,微流控平臺(tái)由無極調(diào)速微注射泵、液氮池及整流閥和顯微鏡組成,用于實(shí)現(xiàn)活體單細(xì)胞操縱及多種反應(yīng)試劑的精確、穩(wěn)定進(jìn)樣;溫度控制平臺(tái)基于虛擬儀器技術(shù),開發(fā)了控制程序和人機(jī)交互界面,以實(shí)現(xiàn)芯片反應(yīng)溫度的實(shí)時(shí)檢測(cè)和精確控制;細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)平臺(tái)由層流生物試驗(yàn)臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)等組成,用于細(xì)胞樣本制備、生化試劑配制和活體細(xì)胞的藥物預(yù)處理等操作;生物信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)由熒光倒置顯微鏡、CCD及相關(guān)圖像采集與分析軟件組成,用于實(shí)現(xiàn)生物熒光信號(hào)的高信噪比、實(shí)時(shí)精確測(cè)量和分析。針對(duì)微流控系統(tǒng)中流體對(duì)細(xì)胞的水動(dòng)力作用難以試驗(yàn)測(cè)量,且細(xì)胞活性受水動(dòng)力影響較大,本文應(yīng)用計(jì)算流體力學(xué)、彈性力學(xué)和塑性力學(xué)理論,借助任意拉格朗日-歐拉法動(dòng)力學(xué)描述、動(dòng)網(wǎng)格技術(shù)和參數(shù)化數(shù)值求解方法,建立并求解兩類芯片的2D、3D細(xì)胞-微流體流固耦合有限元模型。通過模擬細(xì)胞捕捉瞬態(tài)過程,分析流場(chǎng)中細(xì)胞所受的多屬性水動(dòng)力作用,量化芯片入口載流流速與細(xì)胞表面壓力、應(yīng)力分布的關(guān)系。并且,將芯片上的細(xì)胞受力與正常人體動(dòng)脈血管、毛細(xì)血管和組織液中的細(xì)胞受力進(jìn)行對(duì)比,預(yù)測(cè)試驗(yàn)參數(shù)對(duì)細(xì)胞生理活性的影響。選取MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系,基于微磁珠固相萃取技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分子擴(kuò)增與檢測(cè)技術(shù),提出全集成檢測(cè)方法。該方法將微流控單細(xì)胞捕捉、細(xì)胞裂解、mRNA萃取、反轉(zhuǎn)錄、基因片段擴(kuò)增與實(shí)時(shí)定量檢測(cè)等所有試驗(yàn)步驟完全集成到一個(gè)芯片,在簡(jiǎn)化操作、縮短周期的同時(shí)提高低豐度mRNA樣本的保持度,并由此提高檢測(cè)精度、靈敏度和信噪比。本文依次評(píng)估了方法可行性和可重復(fù)性,優(yōu)選了細(xì)胞操縱與mRNA固相萃取試驗(yàn)方案,分析了該方法與傳統(tǒng)方法的效能差異等;并且,檢測(cè)了MMS誘導(dǎo)前后單細(xì)胞內(nèi)持家基因GAPDH與細(xì)胞周期調(diào)控基因CDKN1A表達(dá)水平的差異,驗(yàn)證其藥代動(dòng)力學(xué)機(jī)理;此外,分別建立MMS劑量、用藥時(shí)間對(duì)CDKN1A表達(dá)調(diào)控的影響,提出與本試驗(yàn)條件對(duì)應(yīng)的最優(yōu)治療方案。在理論上,本文改善了現(xiàn)有研究方法的集成度、多功能性和實(shí)驗(yàn)操作的自動(dòng)化水平,并對(duì)同類單細(xì)胞、單分子生化分析具有普適性;在工程實(shí)際中,降低了現(xiàn)有芯片設(shè)計(jì)、制造和操作中普遍存在的復(fù)雜度、高成本和高消耗,且可根據(jù)需求變更而靈活調(diào)整,具有一定的產(chǎn)業(yè)化前景。研究方法與結(jié)論在推進(jìn)微/納制造技術(shù)與基礎(chǔ)科學(xué)研究結(jié)合,促進(jìn)基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究,提升臨床診治水平等方面具有一定的價(jià)值和意義。
[Abstract]:Micro / nano manufacturing mainly studies the functional structure of micrometers, nano scale, and the scientific problems in the design and manufacture of devices and systems. It is one of the symbols to measure the level of national manufacturing. It represents the forefront of the current manufacturing science. Cells are the basic units of life structure and function, and the detection of living single cell gene expression is cell life. The limit state of life analysis technology is of great significance for revealing the mechanism of the occurrence and evolution of major diseases and promoting the development of new drugs. It is becoming an international frontier subject in the fields of basic biology and clinical medicine. In this paper, micro / nano manufacturing technology is combined with single cell gene expression detection, and the microfluidic chip system has been developed to make the routine. The multi-step operation of the biochemical test is fully integrated into a single chip to achieve the extraction, amplification and detection of low abundance mRNA samples in single cell. The main contents are the following aspects: two kinds of chip microsystems with clear layout, simple structure and more flexible manipulation, namely, single working unit and microfluidic array chip. To carry out portable operation and analysis, the latter improves detection efficiency and flux. The two types of chips are multilayer structure, including micro flow layer, control layer, thin film sandwich and micro sensor containing heater. In processing, the same chip technology is improved. The local adhesion of PDMS film in engineering practice is solved, heat circulation reaction reagent evaporation and sensor recovery are solved. In addition, based on the theory of solid, fluid heat transfer, modeling and Simulation of microsensors containing heaters with the aid of general commercial software, the temperature control performance of the design is evaluated. The experimental system platform consists of 4 parts, namely, the microfluidic platform, the temperature control platform, the cell culture test platform and the biological signal. The microfluidic platform is composed of no pole speed control micro injection pump, liquid nitrogen pool and rectifying valve and microscope, which is used to realize single cell manipulation of living body and the accuracy and stability of various reagents. Based on the virtual instrument technology, the temperature control platform has developed the control process and the human-computer interface to realize the real temperature of the chip. The cell culture test platform is composed of laminar biological test rig, cell culture box, centrifuge and so on. It is used for cell sample preparation, biochemical reagent preparation and drug pretreatment of living cells. The biosignal detection platform is composed of fluorescence inverted microscope, CCD and related image acquisition and analysis software. The high signal to noise ratio of the biological fluorescence signal is measured and analyzed in real time. It is difficult to test the hydrodynamic effect of the fluid on the cell in the microfluidic system, and the cell activity is greatly influenced by the hydrodynamic force. In this paper, the computational fluid mechanics, elastic mechanics and plastic mechanics theory, dynamic description of the Lagrange Euler method are used in this paper. Grid technology and parameterized numerical method are used to establish and solve the 2D, 3D cell microfluid fluid solid coupling finite element model of two types of chips. By simulating the transient process, the multi attribute hydrodynamic action of cells in the flow field is analyzed, and the relationship between the flow velocity of the chip entrance and the stress distribution of the cell surface and the stress distribution is quantified. The cell stress on the chip is compared with the normal human arterial blood vessels, capillary and tissue fluid, and the effect of the test parameters on the cell physiological activity is predicted. The MCF-7 human breast cancer cell line is selected based on the microbead solid phase extraction technology and the real-time fluorescence quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR) molecular amplification and detection. This method integrates all the experimental steps such as microfluidic single cell capture, cell lysis, mRNA extraction, reverse transcription, gene fragment amplification and real-time quantitative detection to a single chip. It improves the retention of low abundance mRNA samples while simplifying operation and shortening the cycle, and thus improves detection precision. Sensitivity and signal-to-noise ratio. In this paper, the feasibility and repeatability of the method were evaluated in turn. The scheme of cell manipulation and mRNA solid phase extraction was selected, and the difference between the method and the traditional method was analyzed. And the difference between the single cell GAPDH and the expression level of the cell cycle regulation gene CDKN1A before and after the induction of MMS was detected. In addition, the effects of MMS dose and time on the regulation of CDKN1A expression are established, and the optimal treatment scheme corresponding to the experimental conditions is proposed. In theory, this paper improves the integration degree of the existing research methods, the automation level of multifunction and experimental operation, and the same single cell and single molecule biochemical fraction of the same kind. In engineering practice, it reduces the complexity, high cost and high consumption of existing chip design, manufacturing and operation, and can be adjusted flexibly according to the change of demand. It has a certain industrialization prospect. The research method and conclusion combine the micro / nano manufacturing technology with basic science research, and promote the basic biology. Medical research is of great value and significance in improving the level of clinical diagnosis and treatment.

【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TN492;R440

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