本文選題：粉塵螨　切入點：磷酸丙糖異構酶　出處：《蚌埠醫(yī)學院》2015年碩士論文

【摘要】：目的:在原核表達系統(tǒng)中進行表達純化重組磷酸丙糖異構酶蛋白,并對該蛋白進行過敏原性鑒定。方法:①提取粉塵螨總RNA并逆轉錄成c DNA,RT-PCR擴增粉塵螨磷酸丙糖異構酶基因;②將上述PCR產物與p UC57連接后,熱轉化至E.coli Top10中,涂布于含氨芐霉素(100 mg/L)的LB平板上,37℃培養(yǎng)過夜后從LB平板上挑選白色菌落放入LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng),提取質粒。用Eco R I和Bam H I雙酶切鑒定質粒,公司測序正確后進一步將酶切產物與p ET-32a表達載體連接轉化至E.coli BL21;③利用生物學軟件進行磷酸丙糖異構酶生物信息學分析,根據軟件分析計算所得的數據構造進化樹;④IPTG誘導重組菌株表達;產物經變性、復性、Ni-NTA螯合層析和Superdex75凝膠過濾層析純化;用Western blotting實驗檢測重組磷酸丙糖異構酶的免疫原性;⑤收集4份來自廣州醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床皮試的粉塵螨過敏患者陽性血清和2份健康體檢者血清樣本,用Western blotting、ELISA實驗驗證重組蛋白的過敏原性。進一步將重組磷酸丙糖異構酶蛋白進行人體皮膚點刺實驗,檢測44例人體皮膚點刺中磷酸丙糖異構酶蛋白的陽性率。結果:①結果成功構建重組的克隆載體和表達載體,PCR結果表明在預期位置出現(xiàn)與預期大小相一致特異性條帶。②生物學軟件分析磷酸丙糖異構酶是氨基酸數為247,分子質量為27134的疏水性蛋白。③SDS-PAGE結果顯示,重組磷酸丙糖異構酶蛋白以包涵體的形式在原核生物體系中大量表達,復性純化后的重組磷酸丙糖異構酶純度較高,且重組蛋白能夠與抗His-tag單克隆抗體發(fā)生特異性結合。④Western blotting、ELISA結果顯示,重組磷酸丙糖異構酶與4例粉塵螨過敏患者血清呈強陽性反應,2例健康對照組均為陰性。⑤人體皮膚點刺實驗結果顯示,粉塵螨提取物人體皮膚點刺44例受試者中16例磷酸丙糖異構酶蛋白呈陽性。結論:成功克隆并原核表達粉塵螨磷酸丙糖異構酶,重組的粉塵螨磷酸丙糖異構酶具有較強的過敏原性。
[Abstract]:Objective: to express and purify recombinant propranose isomerase protein in prokaryotic expression system. Methods the total RNA of Dermatophagoides farinae was extracted by 1: 1 and the gene was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The PCR product was linked with p UC57 and then transformed into E.coli Top10. After overnight culture at 37 鈩，

本文編號：1679915