本文選題：福氏志賀氏菌　切入點：適配體　出處：《湖南師范大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：志賀氏菌屬是造成世界范圍流行痢疾和腹瀉的罪魁禍首,全球每年大約有1.6億感染痢疾,其中有超過110萬人死于該疾病(主要是5歲以下兒童)。使用抗生素治療志賀氏菌病是公認的標準療法,但是這種治療手段的實際應用效果受限于耐藥菌株的廣泛流行。鑒于治療和預防志賀氏菌病都存在極大的困難,開發(fā)一種簡單、高靈敏性和特異性的檢測方法已經迫在眉睫。而福氏志賀氏菌作為引起發(fā)展中國家兒童中志賀氏菌病流行的主要病原菌被選為本實驗目標。作為一種單層的二維蜂巢狀晶格結構的碳納米材料,氧化石墨烯既具有出眾的生物相容性、極高的比表面積,又具有極高電子轉移率。此外,它可以通過π-π堆積吸附單鏈DNA,而幾乎不吸附剛性的雙鏈DNA或aptamer-target復合物。它還可以保護單鏈DNA不被酶降解。因此,氧化石墨烯在疾病診斷和生物分析等應用中顯示出其巨大的潛力。通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)從人工合成的隨機寡核苷酸文庫中體外篩選得到的能夠高特異性高親和力結合靶標的單鏈寡核苷酸(DNA或者RNA)被命名為適配體。適配體能夠高親和力和強特異性的結合其相應的靶標如蛋白質、有機物、各種細胞表面受體乃至整個細胞。相比于抗體而言,適配體在耐受高溫,價格低廉,可重復利用,易于合成和修飾等方面表現(xiàn)突出,因此適用于生物傳感器中的識別探針。同時,基于酶的信號放大技術可以輕易的放大適配體-靶標之間的識別作用。因此,適配體可以用于食源性病原體的檢測,尤其適用于檢測環(huán)境,食物和臨床樣本中的細菌。本論文以實現(xiàn)福氏志賀氏菌的快速,高效檢測這一熱點問題為切入點,主要開展了以下兩個方面的研究工作：一、福氏志賀氏菌適配體的篩選和鑒定從DNA文庫中篩選得到一組能夠高親和力和高特異性的結合福氏志賀氏菌的單鏈DNA適配體,然后對其進行分組,克隆和測序。挑選了其中三種單鏈DNA并分別命名為aptamer 1,2,3。與其他兩個候選適配體相比,aptamerl的親和力更高(解離常數(shù)為29±4 nM),因此被選用進行后續(xù)實驗。二、構建適配體傳感器快速檢測福氏志賀氏菌基于酶輔助的信號放大技術,氧化石墨烯和熒光基團修飾的適配體的使用,構建了一個簡單、高靈敏性和特異性的適配體傳感器用以檢測福氏志賀氏菌。此傳感器所使用的信號探針既包含了可以特異性識別靶標的福氏志賀氏菌適配體序列,也包含了限制性內切酶ApaI的識別序列和末端修飾的兩個FAM熒光基團。無靶標的情況下,信號探針會自動吸附到氧化石墨烯表面,熒光信號被淬滅。當加入靶標菌后,適配體會與靶標特異性結合,使熒光探針從氧化石墨烯表面釋放出來,ApaI立刻識別并水解與靶標結合的探針。此外,在后續(xù)過程中,游離的靶標會吸引更多信號探針從氧化石墨烯表面脫離下來。在最適條件下,此傳感器的檢測下限低至100 CFU/mL,并在500-108 CFU/mL之間呈現(xiàn)良好的線性關系,同時具有很高特異性。因此,該適配體傳感器可以替代傳統(tǒng)的致病菌檢測方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5

【共引文獻】

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本文編號：1628207