本文選題：硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶　切入點：單核苷酸多態(tài)性　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景及目的:世界衛(wèi)生組織和歐美地區(qū)大規(guī)模的研究結(jié)果表明,藥物安全性問題是住院病人致死的最重要原因之一,占全部死亡原因的第五位[1,2]。硫嘌呤類藥物,如6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine,6-TG)和硫唑嘌呤(azathiopurine,AZA),是類嘌呤拮抗劑,能夠干擾核苷酸代謝,具有抗增殖和免疫抑制的作用。在臨床上這類藥物主要用于炎癥性腸炎、急性白血病的化療或作為免疫抑制劑廣泛用于器官移植以及自身免疫性疾病的治療。硫嘌呤類藥物本身并無活性或活性很低,它們在體內(nèi)需經(jīng)過酶催化生成6-硫鳥苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)而發(fā)揮藥理作用。硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thiopurine S-methyltransferase,TPMT)是硫嘌呤類藥物在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶,其編碼基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)可以決定TPMT活性,進而直接影響硫嘌呤類藥物的臨床療效和毒性的程度[2-4]。目前對于TPMT的檢測主要有表型及基因型兩種。表型檢測的準(zhǔn)確性受到輸血,藥物相關(guān)作用等因素的影響較為明顯�；蛐蜋z測不會受到上述因素的影響,同時也更為快速和簡便�；蛐蜋z測法正逐步取代表型檢測法,成為TPMT活性檢測的主流手段。如何快速、全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的進行TPMT基因型檢測是當(dāng)前的熱點問題。本課題研究探索并優(yōu)化TPMT基因PCR擴增反應(yīng)的最佳體系,制備了TPMT基因的37種SNP位點。尋找適合每一種SNP位點的內(nèi)切酶,并確定其被酶切后的片段大小。根據(jù)酶切后的片段大小、酶切時孵育的時間和溫度等條件來確定合適的內(nèi)切酶組合。方法:1.利用NCBI的GenBank查找TPMT基因全序列,然后從TPMT基因全序列中查找TPMT外顯子(exon)3-10的序列。合成TPMT外顯子3-10的特異性引物,并對反應(yīng)體系中引物濃度及PCR的退火溫度等進行條件優(yōu)化,建立聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴增體系。利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis,AGE)鑒定擴增引物的特異性和擴增片段的大小。2.使用優(yōu)化后的PCR體系方法來擴增TPMT exon 3-10基因序列,然后將擴增好的PCR產(chǎn)物送上海生工進行目的基因PCR克隆測序(要求提供克隆測序結(jié)果、宿主菌和純化好的質(zhì)粒。對純化后的質(zhì)粒具有如下要求:每種質(zhì)粒至少提供1毫升,濃度為1x10e7copies/ul以上,拷貝數(shù)越大越好。同時要求pcr產(chǎn)物末端帶有a尾。)。用blast軟件把克隆測序結(jié)果和模板序列進行比對,以確定擴增出的外顯子序列的正確性。比對無誤后進行點突變,依據(jù)37種不同的snp位點,將序列中的一個堿基突變成另一個堿基。具體的堿基突變位置如下:exon3(tpmt*03e:rs3931660t140+114a、tpmt*13e:rs72552742a83t、tpmt*14:rs9333569a1g、tpmt*17:ndc124g、tpmt*29:rs267607275t2c、tpmt*30:ndg106a);exon4(tpmt*03e:rs12529220a141-101t、tpmt*5:rs72552740t146c、tpmt*18:nd211ga、tpmt*21:rs200591577c205g);exon5(tpmt*02:rs1800462g238c、tpmt*03d:rs72552739g292t、tpmt*03e:rs2518463t366+58c、tpmt*09:rs151149760a356c、tpmt*19:nda356c、tpmt*27:ndt319g、tpmt*28:ndg349c、tpmt*32:rs115106679g340a、tpmt*34:rs111901354c244t);exon6(tpmt*11:rs72552738g395a、tpmt*12:ndc374t);exon7(tpmt*03b:rs1800460g460a、tpmt*03e:rs2842934c474t、tpmt*10:rs72552737g430c、tpmt*16:rs144041067g488a、tpmt*22:ndg488c、tpmt*33:rs112339338c487t);exon8(tpmt*15:rs9333570g495-1a、tpmt*06:rs75543815a539t、tpmt*23:rs74423290c500g、tpmt*24:rs6921269g537t);exon9(tpmt*26:rs72556347t622c、tpmt*31:rs79901429t611c);exon10(tpmt*04:rs1800584g626-1a、tpmt*03c:rs1142345:a719g、tpmt*07:rs72552736t681g、tpmt*08:rs56161402g644a、tpmt*20:rs150900439a712g、tpmt*25:ndt634c)。野生型序snp列采用pucm-t質(zhì)粒載體,此載體是為簡化pcr產(chǎn)物的克隆而設(shè)計的,適用于3'-末端帶有a尾的pcr產(chǎn)物克隆。突變型snp序列使用puc57質(zhì)粒作為載體。共制備了37種tpmt基因snp位點。3.利用dnassist軟件分析查找tpmt37種snp位點最合適的內(nèi)切酶,但其中有10個snp位點沒有找到合適的內(nèi)切酶。因此通過錯配堿基的方法(使用primerprimer5軟件來設(shè)計錯配堿基的引物)確定合適的酶。利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切后的片段的大小。通過酶切后的片段大小、內(nèi)切酶的孵育時間和溫度等條件對內(nèi)切酶進行組合,同時要求同一組合中酶切后的片段的大小至少相差5bp。結(jié)果:1.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確定最優(yōu)的反應(yīng)條件為:引物濃度為0.4?m,探針濃度為0.1?m,退火溫度為55℃。2.將得到的8個外顯子pcr產(chǎn)物進行克隆并依次測序,通過與標(biāo)準(zhǔn)序列進行對比確定得到的各個外顯子序列的正確性。經(jīng)過BLAST比對,兩者序列匹配�？寺〕龅腡PMT外顯子為野生型序列。為了得到突變型序列,我們依據(jù)突變型的TPMT SNP位點分布,對不同的SNP位點進行點突變。通過這一步驟得到了突變型的TPMT SNP序列。通過上述步驟成功構(gòu)建了TPMT基因的37種SNP位點(野生型和突變型)。3.使用不同的內(nèi)切酶切來識別TPMT基因的37種SNP位點,利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段的大小。通過分析酶切后的片段大小、酶切孵育的時間和溫度對其不同的酶進行合理組合,使其可以全面、更快的判斷來未知樣本的SNP位點情況。結(jié)論:1.本研究優(yōu)化了TPMT基因外顯子3-10擴增反應(yīng)體系,利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定了TPMT基因外顯子3-10擴增產(chǎn)物的正確性。2.利用不同的質(zhì)粒載體構(gòu)建了37種野生型和突變型TPMT基因SNP位點。3.獲取了37種SNP位點相對應(yīng)的內(nèi)切酶,確定了每種SNP位點經(jīng)酶切后片段的大小。通過分析酶切后的片段大小、酶切時孵育的溫度和時間等條件來對其不同的酶進行合理組合,使其可以全面的判斷未知樣本的SNP位點情況。為今后進一步的產(chǎn)品開發(fā)(如基因探針)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉四方;劉曉紅;;硫唑嘌呤/6-巰嘌呤治療炎性腸病前檢測硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的臨床意義[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2006年07期

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本文編號：1606498