本文選題：冠心病　切入點：色譜-質譜聯(lián)用　出處：《武漢大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：冠心病(Coronary Artery Disease,CAD)是一類由遺傳,環(huán)境及其之間的相互作用引起的復雜疾病,確切致病原因至今尚未闡明。多年來流行病學的研究表明,除了遺傳因素以外,生活方式,飲食習慣,環(huán)境暴露等均與冠心病的發(fā)病風險相關。DNA甲基化是一種發(fā)生在DNA序列上的表觀遺傳修飾,可以在轉錄和細胞分裂前后穩(wěn)定的遺傳。越來越多的報道證實,高脂血癥、吸煙、不良的生活習慣等心血管危險因素均可導致相關基因甲基化異常,從而促進心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。由于研究人群的不一致及方法學的局限,以往的研究結果對于冠心病患者外周血白細胞DNA總體甲基化水平的變化情況沒有取得一致的認識。本課題研究第一部分,共收集外周血樣本435例(215例冠心病患者,220例健康對照),利用色譜-質譜聯(lián)用技術檢測外周血白細胞DNA總體甲基化(5-mdC/dG,m6A/A)水平,并用熒光定量PCR技術檢測了3個DNA甲基化轉移酶(DNM1,DNMT3A,DNMT3B)及3個脂代謝相關基因(SREBP-1,HMGCR, MLXIP)mRNA的表達水平,通過統(tǒng)計學檢驗兩組樣本之間甲基化水平及基因表達水平的差異。第二部分,建立THP-1泡沫細胞模型,利用色譜-質譜聯(lián)用技術檢測單核細胞泡沫化前后DNA總體甲基化水平的改變情況；在THP-1泡沫細胞中轉染DNMT1全長質粒,采用質譜法檢測SREBP-1啟動子區(qū)域甲基化水平的改變情況,并通過熒光定量PCR,Western Blot技術檢測脂代謝基因SREBP-1 mRNA及蛋白表達情況。第三部分,共收集外周血樣本954例(476例冠心病患者和478例健康對照),依據(jù)Haploview軟件提供的SNP連鎖圖挑取5個DNMT1 tag-SNP位點(rs2228611, rs16999593, rs7253062,rs2336691, rs4804494)。采用高分辨率熔解曲線法(HRM)檢測樣本中此5個SNP位點基因型,并通過統(tǒng)計學檢驗分析兩組人群中5個位點及單體型的分布差異情況。該課題第一部分主要研究發(fā)現(xiàn)：1)研究中健康漢族人群外周血白細胞樣本DNA總體5-mdC/dG水平和年齡,外周血清總膽固醇水平呈負相關；2)冠心病患者外周血白細胞基因組5-mdC/dG含量顯著低于對照人群,總體5-mdC/dG含量降低是冠心病的潛在風險因素(odds ratio(OR)=2.454,95% confidence interval(CI)=1.665～3.617,校正P=5.789×10-6)；患者外周血白細胞基因組m6A/A含量顯著高于對照人群,m6A/A含量增高是冠心病的潛在風險因素(OR=0.655,95%CI=0.448～0.957,校正P=0.029)；3)冠心病患者外周血白細胞DNMT1 mRNA表達水平顯著增高,SREBP-1 mRNA表達水平顯著降低。4)THP-1單核細胞泡沫化進程中基因組總體甲基化水平(5-mdC/dG, m6A/A)顯著降低,DNMT1表達水平降低；5)THP-1泡沫細胞轉染DNMT1全長質粒后,SREBP-1啟動子特定CG位點啟動子甲基化水平增高,SREBP-1 mRNA及蛋白表達水平降低。6)DNMT1基因上兩個多態(tài)性位點(rs2228611和rs2336691)的基因型與CAD的患病風險有關聯(lián)；7)rs7253062與脂質代謝相關；8)在單體型分析中基因型G-T-A-A-T(等位基因順序依次為：rs2228611, rs16999593, rs7253062, rs2336691和rs4804494)與CAD的患病風險相關聯(lián)。本研究提示DNA甲基化調控在冠心病的發(fā)病機制中扮演了重要角色,外周血白細胞DNA整體甲基化水平減低可能是冠心病的潛在風險因素；冠心病病理進程中的重要步驟-單核細胞的泡沫化受到了甲基化的調控,脂質代謝基因SREBP-1啟動子區(qū)異常的甲基化改變了該基因的正常表達；DNMT1的基因多態(tài)性與冠心病關聯(lián)。
[Abstract]:Coronary heart disease (Coronary Artery Disease, CAD) is a complex disease caused by genetic and environmental interaction between and the exact cause has not been elucidated. Years of research and Epidemiology showed that besides genetic factors, lifestyle, dietary habits, environmental exposure and incidence of coronary artery disease were risk associated with.DNA methylation is epigenetic modifications occur in an DNA sequence on the table, in the genetic transcription and cell division before and after stable. More and more reports confirmed, hyperlipidemia, smoking, bad habits and other cardiovascular risk factors can lead to abnormal methylation of related genes, so as to promote the development of cardiovascular disease. Because the study group the inconsistencies and methodological limitations of previous research results of DNA for white blood cells in peripheral blood of patients with coronary heart disease total methylation level did not have a By understanding this topic. The first part of the study, collected peripheral blood samples of 435 cases (215 cases of coronary heart disease patients and 220 healthy controls), using gas chromatography-mass spectrometry DNA white blood cell detection in peripheral blood total methylation (5-mdC/dG, m6A/A) level, using fluorescence quantitative PCR detection of 3 DNA methyltransferase (DNM1, DNMT3A, DNMT3B) and 3 genes related to lipid metabolism (SREBP-1, HMGCR, MLXIP) the expression level of mRNA, test the expression of methylation level and gene between the two sample groups by statistics. In the second part, the establishment of THP-1 foam cell model, combined with the changes of detection before and after bubble monocyte DNA total methylation level by gas chromatography - mass spectrometry; in THP-1 foam cells stained transfer DNMT1 plasmid, the change detection of SREBP-1 promoter methylation level by mass spectrometry, and by fluorescence quantitative PCR, Western The expression of Blot in detection of lipid metabolism gene SREBP-1 mRNA and protein. The third part, collected peripheral blood samples of 954 cases (476 cases of coronary heart disease patients and 478 healthy controls), 5 DNMT1 tag-SNP sites based on Haploview software provided by the SNP linkage map (rs2228611, rs16999593, were rs7253062, rs2336691, rs4804494) with high. Resolutionmelting curve method (HRM) detection in a sample of the 5 SNP loci, and through statistical analysis of differences between the two groups in the distribution of 5 loci and haplotypes. The first part mainly study found that: 1) the healthy Han population of peripheral white blood cell samples DNA 5-mdC/dG level and overall age was negatively related to total cholesterol levels in peripheral blood of patients with coronary heart disease; 2) peripheral white blood cell genomic 5-mdC/dG content was significantly lower than the control group, the overall 5-mdC/dG content reduced latent coronary heart disease In the risk factors (odds ratio (OR) =2.454,95% confidence interval (CI) =1.665 ~ 3.617, corrected P=5.789 x 10-6); patients with peripheral white blood cell genomic m6A/A content was significantly higher than that of the control group, the increase of m6A/A content is a potential risk factor for coronary heart disease (OR=0.655,95%CI= 0.448 ~ 0.957, P=0.029; 3) correction) patients with coronary heart diseases white blood cells DNMT1 mRNA expression level was significantly increased, the expression level of SREBP-1 mRNA decreased significantly.4) level in whole genome methylation of THP-1 foam mononuclear cells in the process (5-mdC/dG, m6A/A) significantly decreased, the expression level of DNMT1 decreased; 5) THP-1 foam cells transfected with DNMT1 full-length plasmid, SREBP-1 promoter methylation of specific CG sites the level of increased expression of SREBP-1 protein and mRNA levels decreased.6) DNMT1 gene two polymorphism loci (rs2228611 and rs2336691) associated risk genotype and the prevalence of CAD Rs7253062; 7) and associated with lipid metabolism; 8) in haplotype analysis in genotype G-T-A-A-T (allele sequence: rs2228611, rs16999593, rs7253062, rs2336691 and rs4804494) and the risk of CAD associated. This study suggests that DNA methylation plays an important role in the pathogenesis of coronary heart disease. DNA, peripheral blood leukocytes may reduce the overall level of methylation is a potential risk factor for coronary heart disease; coronary heart disease is an important step in the pathological process of monocyte foam by methylation regulation of lipid metabolism, SREBP-1 gene promoter methylation abnormalities of the normal expression of the gene polymorphism of DNMT1 gene; the association with coronary heart disease.

【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4;R440

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本文編號：1566176