發(fā)布時間：2018-02-22 08:55

  本文關(guān)鍵詞： Fcgr3B 拷貝數(shù)變異 膿毒癥 膿毒癥 FcγRⅢB Fcgr3B 中性粒細(xì)胞 凋亡 FcγRⅢB Fcgr3B 中性粒細(xì)胞 凋亡 TNF-α　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：前 言膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),是臨床常見的急危重癥,是急性腎損傷(AKI)的主要致病原因,發(fā)病率和死亡率均居高不下。明確膿毒癥的發(fā)病機制,尋找膿毒癥發(fā)病的易感基因,探索新的有效的治療方案,已成為全球急危重癥醫(yī)學(xué)的研究熱點。近年來研究認(rèn)為,膿毒癥是一種微循環(huán)障礙疾病。膿毒癥疾病進展與組織血氧供需失衡有關(guān)。若微循環(huán)障礙得不到及時糾正,膿毒癥患者便會進展至多器官功能障礙階段,死亡率極高。中性粒細(xì)胞是外周血中數(shù)量最多的白細(xì)胞,是機體抵御病原體入侵的第一道防線。中性粒細(xì)胞凋亡在膿毒癥疾病進展的不同時期具有不同的作用。膿毒癥疾病進展早期,機體處于炎癥爆發(fā),免疫亢進階段,中性粒細(xì)胞作為主要的炎癥源,其凋亡有利于抑制炎癥反應(yīng)；但在膿毒癥疾病進展晚期,機體處于免疫抑制階段,中性粒細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致其穿越血管壁進入炎癥病灶消滅病原體的能力減弱,且中性粒細(xì)胞凋亡后產(chǎn)生的凋亡小體不能被巨噬細(xì)胞清除。凋亡小體不僅是新的炎癥源,還會堵塞微血管,造成組織缺氧。上述因素均不利于膿毒癥患者的預(yù)后。FcγRⅢB是唯一表達于人中性粒細(xì)胞表面的Fc伽瑪受體。目前研究認(rèn)為,FcγRⅢB表達缺陷的個體不易發(fā)生細(xì)菌感染,且FcγRⅢB具有調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡的作用。本研究旨在探索FcγRⅢB在膿毒癥疾病進展晚期時對中性粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用,以及FcγRⅢB對膿毒癥疾病進展的影響。編碼FcγRⅢB的基因Fcgr3B具有拷貝數(shù)變異(CNV)的特點。拷貝數(shù)變異是一種與疾病易感性及個體差異性相關(guān)的基因改變。目前研究認(rèn)為,Fcgr3B基因的拷貝數(shù)變異與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病相關(guān)。本研究希望通過檢測重癥膿毒癥患者Fcgr3B基因拷貝數(shù)的情況,來了解FcγRⅢB在膿毒癥中的作用,以及Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性是否為膿毒癥患者個體差異性表現(xiàn)的一個原因。FcγRⅢB是一種GPI錨定蛋白,胞內(nèi)段缺陷。因此FcγRⅢB需要通過其它具有胞內(nèi)段的信號分子來達到向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的目的,例如FcγRⅢB或Mac-1。目前研究認(rèn)為,FcγRⅢB具有調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞凋亡和吞噬功能的作用。本研究通過檢測FcγRⅢB在膿毒癥體內(nèi)環(huán)境下對中性粒細(xì)胞凋亡及吞噬功能的影響,來了解FcγRⅢB在膿毒癥疾病進展過程中的作用；并通過體外實驗驗證FcγRⅢB與中性粒細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,尋找關(guān)鍵作用因子。第一部分Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性與重癥膿毒癥的相關(guān)性研究目的通過檢測重癥膿毒癥患者和健康人群Fcgr3B基因拷貝數(shù)變異的情況,來了解FcγRⅢB在膿毒癥中的作用,以及Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性是否為膿毒癥患者個體差異性表現(xiàn)的一個原因。方法提取468例重癥膿毒癥患者及450例健康人外周血DNA,以Fcgr3B基因2拷貝的DNA樣本為標(biāo)準(zhǔn)品,實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測其Fcgr3B基因拷貝數(shù)。比較重癥膿毒癥患者和健康人群之間Fcgr3B基因拷貝數(shù)的差異。結(jié)果重癥膿毒癥患者中Fcgr3B基因0,1,2,3,4,5,和6拷貝的頻率分別為0.2%,18.6%,51-3%,26.5%,1.9%,0.4%,和1.1%;健康人群中Fcgr3B基因0,1,2,3,4,5,和6拷貝的頻率分別為2.4%,39.3%,47.3%,6.9%,2.7%,0.9%,和0.4%。以Fcgr3B基因2拷貝為界,定義2拷貝為低拷貝組,2拷貝為高拷貝組,重癥膿毒癥患者中Fcgr3B基因2拷貝,2拷貝,和2拷貝的頻率分別為18.8%,51.3%,和29.9%；健康人群中Fcgr3B基因2拷貝,2拷貝,和2拷貝的頻率分別為41.8%,47.3%,和10.9%；重癥膿毒癥患者高拷貝個體頻數(shù)明顯高于健康人群(卡方值84.01,自由度2,P0.0001)。Logistic回歸分析提示,Fcgr3B基因高拷貝個體發(fā)生感染后進展至重癥膿毒癥的可能性較大(OR=2.536,95%可信區(qū)間1.745-3.686,P0.0001)；而Fcgr3B基因低拷貝個體發(fā)生感染后進展至重癥膿毒癥的可能性較小(OR--0.415,95%可信區(qū)間0.304-0.568,P0.0001)。結(jié)論中國漢族人群中Fcgr3B基因高拷貝(2拷貝)個體發(fā)生感染后進展至重癥膿毒癥的可能性更大。Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性是膿毒癥患者個體差異性表現(xiàn)的一個原因。第二部分 中性粒細(xì)胞FcγRⅢB在小鼠膿毒癥模型中的作用研究目的通過建立Fcgr3B轉(zhuǎn)基因小鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥模型,來研究FcγRⅢB在膿毒癥疾病進展中的作用。方法實驗組Fcgr3B+轉(zhuǎn)基因小鼠基因型為Fcgr3B+Fcer1g+/+, Fcgr3B+Fcer1g-/-和Fcgr3B+Fcgr2A+Fcer1g-/-,對照組Fcgr3B-轉(zhuǎn)基因小鼠基因型為Fcer1g+/+(野生型)和Fcer1g-/-,均為C57BL/6小鼠,均通過基因鑒定入組實驗。以上5種基因型小鼠均分為CLP膿毒癥模型組和假手術(shù)組,分別觀察各基因型小鼠膿毒癥組的生存時間,并檢測各基因型小鼠膿毒癥組和假手術(shù)組的血乳酸水平,血TNF-α水平,中性粒細(xì)胞凋亡水平,和中性粒細(xì)胞吞噬功能情況。結(jié)果實驗組Fcgr3B+轉(zhuǎn)基因膿毒癥小鼠的死亡率高于對照組Fcgr3B-轉(zhuǎn)基因膿毒癥小鼠(P0.05)。各基因型小鼠均在CLP術(shù)后20小時開始出現(xiàn)死亡。為了模擬重癥膿毒癥的疾病進展過程,我們選擇CLP術(shù)后20小時為觀察點,比較以下各項指標(biāo)的差異。實驗組Fcgr3B+轉(zhuǎn)基因膿毒癥小鼠的血乳酸水平,血TNF-α水平,中性粒細(xì)胞凋亡水平均高于對照組Fcgr3B-轉(zhuǎn)基因膿毒癥小鼠(P0.05)；各基因型小鼠膿毒癥組血乳酸水平,血TNF-α水平,中性粒細(xì)胞凋亡水平均高于假手術(shù)組(P0.05)。實驗組Fcgr3B+轉(zhuǎn)基因膿毒癥小鼠中性粒細(xì)胞的吞噬功能低于對照組Fcgr3B-轉(zhuǎn)基因膿毒癥小鼠(P0.05)；各基因型小鼠膿毒癥組中性粒細(xì)胞吞噬功能均低于假手術(shù)組(P0.05)。結(jié)論Fcgr3B+膿毒癥小鼠表現(xiàn)出顯著的高死亡率,高血乳酸水平,高促炎因子TNF-α水平,其中性粒細(xì)胞凋亡增加,而吞噬功能減弱。以上結(jié)果提示FcγRⅢB在膿毒癥體內(nèi)環(huán)境下具有促進中性粒細(xì)胞凋亡的作用,且FcγRⅢB的這種作用削弱了機體的免疫力,促進了膿毒癥疾病的進展。第三部分FcγRⅢB與中性粒細(xì)胞凋亡關(guān)系的體外研究目的通過體外實驗驗證FcγRⅢB與中性粒細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,尋找關(guān)鍵作用因子。方法分別提取健康Fcgr3B+Fcer1g+/+, Fcer1g+/+(野生型),Fcgr3B+Fcer1g-/-Fcgr3 B+Fcgr2A+Fcer1g-/-, Fcer1g-/-小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞,平均分為4份,分別是空白對照組(對照組1)、TNF-α刺激組(對照組2)、TNF-α+二抗刺激組(對照組3)、和TNF-α+FcγRⅢB交聯(lián)刺激組(實驗組),比較各組細(xì)胞之間的凋亡水平和凋亡相關(guān)信號分子的表達程度。結(jié)果Fcgr3B+轉(zhuǎn)基因小鼠]TNF-α+FcγRⅢB交聯(lián)刺激組中性粒細(xì)胞的凋亡水平明顯高于其它對照組(P0.05)；而Fcgr3B-轉(zhuǎn)基因小鼠TNF-α+FcγRⅢB交聯(lián)刺激組中性粒細(xì)胞的凋亡水平與其它對照組相比,無明顯差異。Western blot提示Fcgr3B+轉(zhuǎn)基因小鼠TNF-α+FcγRⅢB交聯(lián)刺激組中性粒細(xì)胞的活化型caspase8,活化型caspase 3, SHIP和磷酸化型SHIP的表達水平均高于其它對照組；而Fcgr3B-轉(zhuǎn)基因小鼠TNF-α+FcγRⅢB交聯(lián)刺激組中性粒細(xì)胞的凋亡相關(guān)信號分子的表達水平與其它對照組相比,無明顯差異。結(jié)論體外實驗證明FcγRⅢB聯(lián)合TNF-α具有促進中性粒細(xì)胞凋亡的作用,此過程與信號分子Caspase 8,Caspase 3和SHIP的活化有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7

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本文編號：1524018