本文關(guān)鍵詞： SDESA-ELISA配對標(biāo)記酶 PAAS 易錯(cuò)PCR 高通量篩選　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)在臨床檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)及生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,但經(jīng)典ELISA只能測定單組份且效率低�；诳焖僮儞Q光度計(jì)測量波長能實(shí)現(xiàn)光度法雙酶同鋇(?) (spectrophotometric-dual- enzyme-simuLtaneous assay, SDESA) 。用ELISA基于SDESA同步測定兩組份稱SDESA-ELISA,其使分析效率加倍。酶標(biāo)儀標(biāo)配濾光片為405 nm和450 nm; SDESA-ELISA配對標(biāo)記酶為水解酶并需滿足以下條件：(1)標(biāo)記酶A水解顯色底物A的最大等吸收波長在405nm附近,標(biāo)記酶B所得顯色產(chǎn)物B的最大差吸收峰在405 nm附近；(2)配對標(biāo)記酶緩沖液兼容,且比活都足夠高；(3)配對標(biāo)記酶都有良好穩(wěn)定性；(4)兩種標(biāo)記酶的顯色產(chǎn)物和顯色底物對酶活性干擾可忽略。篩選發(fā)現(xiàn)4-硝基-萘基磷酸酯(4-nitro-1-naphthy lphosphate,4NNPP)為底物A,大腸桿菌堿性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase, ECAP)活性和穩(wěn)定性都滿足要求,需篩選與其最適緩沖液相容且顯色底物及產(chǎn)物對活性無干擾的標(biāo)記酶B。限于最適pH,僅乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase, AChE)及綠膿桿菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsuLphatase, PAAS)為候選標(biāo)記酶B。本項(xiàng)目比較PAAS和AChE與ECAP配對進(jìn)行SDESA的有效性和性能差異,并建立PAAS定向進(jìn)化系統(tǒng)。1.ECAP和AChE組合進(jìn)行SDESA的表征ECAP水解4NNPP產(chǎn)物4-硝基-1-萘酚(4-Nitro-1-naphthyl,4NNP)在450nm附近有最大差吸收峰波長,在405nm附近為最大等吸收波長。AChE催化硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine chloride, ATCh)水解后在顯色劑5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲)(5,5-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB)作用下產(chǎn)物為NTB,在410nm左右有最大差吸收峰波長。ECAP和AChE在相同堿性Tris-HCl緩沖液中比活和穩(wěn)定性基本滿足要求。對ECAP和AChE,校正吸收后SDESA靈敏度、檢測限、線性范圍與單組份測定一致。但ATCh穩(wěn)定性差,不便于配制即開即用試劑盒。2. ECAP和PAAS組合進(jìn)行SDESA的表征PAAS催化對硝基苯酚硫酸鉀(4-nitrophenol potassium,4PNS)水解產(chǎn)物對硝基苯酚(Nitrophenol,4PNP)最大差吸收峰在405nm左右。ECAP和PAAS在堿性DEA-HCl緩沖液中均表現(xiàn)出其最佳比活；對ECAP和PAAS進(jìn)行SDESA的靈敏度、檢測限、線性范圍與單組份測定基本一致,且顯色底物光譜性質(zhì)更匹配,顯色底物很穩(wěn)定。野生型PAAS最高比活僅為39 kU/g,37度熱失活半衰期僅4天。為了靈敏度與單組份ELISA相當(dāng),PAAS突變體的活性需提高20倍以上且在37度15天活性保留85%以上。因此,需對PAAS進(jìn)行分子改造提高活性和穩(wěn)定性,才能與堿性磷酸酶組合用于SDESA-ELISA。3. PAAS的定向進(jìn)化系統(tǒng)據(jù)PAAS編碼序列全合成基因插入pET28a構(gòu)建N-端帶6His的表達(dá)載體,最后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中表達(dá)成功。用易錯(cuò)PCR(Error-pronePCR)針對PAAS的C端水解酶進(jìn)行突變獲得突變體以建立定向進(jìn)化系統(tǒng)。改變Mg2+、Mn2+、Tm,或組合進(jìn)行易錯(cuò)PCR,再酶切、連接后將突變序列在大腸桿菌中表達(dá)得到PAAS突變體。將LB平板上單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后測序,選取突變率為0.5%-2.0%的易錯(cuò)PCR條件作為建立PAAS突變體庫的優(yōu)選條件。已報(bào)道方法高通量篩選酶突變體庫工作量大、漏檢率高、準(zhǔn)確度低。本文建立如下的高通量篩選方案：(1)48孔板高通量培養(yǎng)PAAS單克隆菌方法：批內(nèi)和批間變異系數(shù)約20%,主要原因是LB平板的單克隆生長差異無法消除；(2)高通量堿裂解誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)胞。裂解液緩沖液含1.0MTris-HCl(Ph 9.0)、輔助成份吐溫-20(1/1000)和對氨基苯甲脒(2u M)。堿裂解液與PAAS菌液誘導(dǎo)表達(dá)后菌液按8：1比例混合,室溫震蕩裂解3-6小時(shí),裂解液中酶活性達(dá)到平臺(tái)；(3)在酶標(biāo)儀用96孔板中高通量測定堿裂解液中PAAS活性；(4)選擇PAAS活性相差2倍的突變體M72Q和G138S,受試者工作曲線(ROC)分析曲線下面積(AUC),選擇90%敏感度對應(yīng)最大特異度的活性為閾值識(shí)別比活增加1倍以上的陽性突變體。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.6

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