本文關(guān)鍵詞：基于DNA催化頸環(huán)自組裝致病菌檢測新方法研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 比色傳感器 肺炎鏈球菌 核酸檢測 鼠傷寒沙門氏菌 核酸適體

【摘要】：近年來,細(xì)菌感染成為一個(gè)全社會共同關(guān)注的嚴(yán)峻問題。尤其是抗生素廣泛甚至不合理使用,導(dǎo)致耐藥性相當(dāng)嚴(yán)重。超級細(xì)菌的產(chǎn)生已引起醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。另外,在細(xì)菌感染的診斷、監(jiān)測以及醫(yī)院感染的流行病學(xué)調(diào)查、消毒滅菌效果的評價(jià)等方面,臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)也具有特別重要的作用。因此,建立一種通用、簡單、快速、價(jià)廉、靈敏、特異的對病原菌檢測方法顯得極其重要。本研究主要包括以下兩個(gè)部分：1.基于DNA催化頸環(huán)自組裝高靈敏檢測肺炎鏈球菌的比色傳感研究肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是一種常見的致病菌,可以引起一系列感染性疾病,如社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥等。本研究以肺炎鏈球菌lytA基因的部分序列為靶物質(zhì),結(jié)合一個(gè)DNA信號轉(zhuǎn)換器和頸環(huán)自組裝(catalyzed hairpin assembly, CHA)信號放大策略,構(gòu)建DNAzyme比色傳感器對其進(jìn)行高靈敏度的檢測。將靶物質(zhì)DNA與一個(gè)轉(zhuǎn)換器頸環(huán)DNA相結(jié)合,形成新的核酸序列并打開頸環(huán),暴露出頸環(huán)干封住的核酸序列,以此觸發(fā)CHA循環(huán)放大反應(yīng)。催化頸環(huán)自組裝反應(yīng)后,產(chǎn)物含有大量自由的并且富含鳥嘌呤G的核酸鏈。當(dāng)氯化高鐵血紅素存在的情況下,可與富含鳥嘌呤的核酸鏈結(jié)合形成G-四聯(lián)體復(fù)合物,即DNAzyme。DNAzyme具有類辣根過氧化物酶活性,在H202存在的情況下,能夠催化底物2,2’-連氮基-雙-(3-乙基并二氫噻唑啉-6-磺酸)二價(jià)陰離子(ABTS2-)氧化成藍(lán)綠色物質(zhì)ABTS-。在最優(yōu)條件下,50 pM-200nM的濃度范圍內(nèi)吸光度值與合成靶序列的濃度對數(shù)成線性關(guān)系,最低檢測限是32 pM。該方法不僅成功地用于檢測PBS緩沖液中S.pn,其最低檢測線為156 CFUmL-1,還應(yīng)用于檢測臨床樣本中的S.pn,并可通過肉眼分析結(jié)果。另外,該方法在近緣種鏈球菌和其他主要致病菌中展示了很好的特異性。因此該傳感器將能夠?yàn)榕R床病原微生物診斷提供有力的工具。2.基于核酸適體的通用型比色傳感器直接檢測鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌屬革蘭陰性腸桿菌,是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一。目前致病菌的檢測方法主要有：傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。但這些方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、需要專業(yè)人員及較高實(shí)驗(yàn)條件等。因此,現(xiàn)場、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測和鑒定致病菌極為重要。本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于核酸適體特異性識別靶細(xì)菌,利用CHA模板進(jìn)行信號循環(huán)放大的通用型比色傳感器,可對各種細(xì)菌進(jìn)行高靈敏檢測。當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌存在時(shí),與特異性核酸適體結(jié)合釋放出CHA模板觸發(fā)序列,催化頸環(huán)自組裝,暴露G-四聯(lián)體與氯化高鐵血紅素結(jié)合,催化ABTS2-和H2O2產(chǎn)生顏色變化,根據(jù)顏色變化程度對靶細(xì)菌進(jìn)行定量分析。將該檢測技術(shù)應(yīng)用于PBS緩沖液中鼠傷寒沙門氏菌的檢測,最低檢測線可到103 CFU mL-1,用時(shí)僅2小時(shí)。同時(shí),該方法僅僅通過改變轉(zhuǎn)換器的序列,實(shí)現(xiàn)對不同的靶物質(zhì)核酸和細(xì)菌的間接或直接檢測,展示了其通用性。所建立的簡單、通用的新方法已成功用于沙門氏菌的檢測,有望該檢測策略為其他臨床病原菌的檢測提供了一個(gè)新的檢測手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5

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本文編號：1416114