本文關(guān)鍵詞：供者B細(xì)胞及抗體的產(chǎn)生在慢性GVHD中的作用　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景及目的異基因造血干細(xì)胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)廣泛應(yīng)用于治療血液系統(tǒng)腫瘤與非血液系統(tǒng)腫瘤、再生障礙性貧血、遺傳與代謝性疾病等。移植物抗宿主(Graft-versus-host disease,GVHD)是allo-HSCT后主要的致病及致死原因,限制了其的廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)上,根據(jù)發(fā)病的時(shí)間,GVHD分為急性GVHD(acute GVHD,aGVHD)和慢性GVHD(chronic GVHD,cGVHD),移植后前一百天之內(nèi)發(fā)生的GVHD定義為急性GVHD,移植后一百天之后發(fā)生的GVHD定義為慢性GVHD。然而這種定義現(xiàn)在已經(jīng)不精確及不適用了,在接受非清髓預(yù)處理方案或者供者淋巴細(xì)胞輸注的病人一百天之后仍可發(fā)生急性GVHD,而慢性GVHD可發(fā)生在移植后一百天之內(nèi)伴隨著的急性GVHD的發(fā)生。急性GVHD包括經(jīng)典的急性GVHD(紅斑丘疹,胃腸道癥狀或瘀膽型肝炎)還包括移植100天后持續(xù)反復(fù)發(fā)作或者晚發(fā)的急性GVHD。慢性GVHD包括經(jīng)典的慢性GVHD(硬皮病,狼瘡樣綜合癥,皮膚粘膜干燥綜合癥,慢性肝病以及閉塞性細(xì)支氣管炎等),還包括重疊綜合癥,即伴隨典型急性GVHD發(fā)生的慢性GVHD。過去三十年里,慢性GVHD的預(yù)防和治療沒有很大的突破,原因在于對(duì)于慢性GVHD的發(fā)病機(jī)理缺乏理解。不同于急性GVHD,慢性GVHD與自身免疫性疾病有許多相似之處,如硬皮病,狼瘡樣綜合癥,血清IgG自身抗體水平升高,系統(tǒng)性膠原沉積。慢性GVHD的免疫病理更加復(fù)雜。急性GVHD是同種異體反應(yīng)性的供者T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)。預(yù)處理方案,高劑量的放化療導(dǎo)致組織損害,損害的組織釋放促炎細(xì)胞因子(如IL-1b和TNF-a),趨化因子,以及細(xì)菌產(chǎn)物(LPS),病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)等,他們導(dǎo)致宿主固有免疫細(xì)胞包括抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)的激活。激活的宿主抗原提呈細(xì)胞如:樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)遷移到輸出淋巴結(jié),在那里激活同種異體反應(yīng)性供者T細(xì)胞。供者的CD4~+T細(xì)胞分化為T輔助細(xì)胞1(T helper 1,Th1),T輔助細(xì)胞2(Thelper 2,Th2)和T輔助細(xì)胞17(Thelper 17,Thl7);供者的CD8+T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞 1(cytotoxicTcell1,Tc1),細(xì)胞毒性T細(xì)胞2(cytotoxicTcell2,Tc2),和細(xì)胞毒性T細(xì)胞17(cytotoxic Tcell 17,Tc17)。由于炎癥微環(huán)境的影響,同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞主要分化為T輔助細(xì)胞1和細(xì)胞毒性T細(xì)胞1。激活的T細(xì)胞遷移到GVHD靶器官(如腸道,肝臟,肺臟和皮膚)。在那里T細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子,動(dòng)員供者類型的固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)急性GVHD的發(fā)生。慢性GVHD由自體反應(yīng)性CD4~+T和B細(xì)胞介導(dǎo),慢性GVHD經(jīng)常伴隨著急性GVHD的發(fā)生。在急性GVHD中,激活的T細(xì)胞浸潤(rùn)胸腺,破壞胸腺上皮細(xì)胞,導(dǎo)致胸腺的陰性選擇破壞,產(chǎn)生自體反應(yīng)性T細(xì)胞。GVHD破壞胸腺,導(dǎo)致自體反應(yīng)性致病性的T細(xì)胞增加,Foxp3+天然調(diào)節(jié)性的T細(xì)胞降低。這些自體反應(yīng)性T細(xì)胞在外周與供者的樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞相互作用。這種相互作用導(dǎo)致自體反應(yīng)性T細(xì)胞向TTh1,Th2和Th17分化.這種相互作用還激活自體反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體。而且在急性GVHD中,一些同種異體反應(yīng)性CD4~+T細(xì)胞,它們也可與供者樹突狀細(xì)胞以及B細(xì)胞相互作用,在外周持續(xù)擴(kuò)增。隨著急性GVHD的減弱,Th1細(xì)胞相對(duì)減少,Th17和Th2細(xì)胞相對(duì)擴(kuò)增。同種自體反應(yīng)性CD4~+T,B細(xì)胞和他們產(chǎn)生的抗體共同介導(dǎo)慢性GVHD的發(fā)生。在慢性GVHD的發(fā)病機(jī)制中,自體反應(yīng)性CD4~+T釋放出纖維化細(xì)胞因子如IL-2,IL-10及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGFβ1)。這些細(xì)胞因子進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞,產(chǎn)生血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和TGFβ1。這些分子誘導(dǎo)組織成纖維細(xì)胞的活化和增殖以及膠原的大量產(chǎn)生。Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17,IL-6,IL-21,IL-22導(dǎo)致皮膚的損害。作為有效的抗原提呈細(xì)胞,供者B細(xì)胞增強(qiáng)移植物中自體反應(yīng)性CD4~+T的擴(kuò)增,增強(qiáng)供者的CD4~+T向Th2和Th17分化。慢性GVHD的發(fā)生還與B細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)相關(guān),慢性GVHD的病人中天然B細(xì)胞的數(shù)目相對(duì)下降,激活的記憶類CD27~+B細(xì)胞數(shù)目相對(duì)增高。TNF家族中B細(xì)胞激活因子(B cell-activating factor,BAFF)與慢性GVHD的發(fā)展以及嚴(yán)重程度相關(guān)。高水平的BAFF促進(jìn)同種異體反應(yīng)性和自體反應(yīng)性B細(xì)胞的生存,同種自體反應(yīng)性B細(xì)胞促進(jìn)慢性GVHD的發(fā)生。B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體在慢性GVHD中的作用仍不清楚。一方面,有人報(bào)道對(duì)血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)產(chǎn)生的刺激性自身抗體可在系統(tǒng)性硬皮病及慢性GVHD的病人中發(fā)現(xiàn),但是沒有發(fā)生慢性GVHD的病人未發(fā)現(xiàn),體外anti-PDGFR抗體可以誘導(dǎo)人類纖維細(xì)胞膠原的產(chǎn)生。在性別不相合的移植中,針對(duì)H-Y次要組織相容性抗原的抗體也與慢性GVHD的發(fā)生相關(guān)。還有人報(bào)道,在小鼠模型中,供者B細(xì)胞同種異體反應(yīng)性抗體的沉積,特別是IgG2c的沉積,與肺支氣管阻塞,肝臟的纖維化等慢性GVHD的發(fā)生相關(guān)。鑒于這些發(fā)現(xiàn),抗體可能在慢性GVHD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。另一方面有人報(bào)道轉(zhuǎn)移GVHD老鼠自體反應(yīng)性抗體到正常的老鼠體內(nèi),并不能產(chǎn)生自身免疫性疾病;還有人報(bào)道顯示B細(xì)胞可以不依賴于抗體直接導(dǎo)致系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生。而且迄今為止,抗體參與慢性GVHD的病理學(xué)還沒有被證實(shí)。在人身上除了自身抗體依賴的自身免疫現(xiàn)象如免疫介導(dǎo)的溶血或者血小板減少癥,沒有直接的證據(jù)顯示自體反應(yīng)性抗體或者同種異體反應(yīng)性抗體導(dǎo)致慢性GVHD器官的損害。最重要的一點(diǎn)是,當(dāng)檢測(cè)到同種異體反應(yīng)性或自體反應(yīng)性抗體,可能僅能證明B細(xì)胞存在,無法證明是B細(xì)胞導(dǎo)致疾病的發(fā)生還是抗體產(chǎn)生的作用。綜上所述,為了解決上述問題并區(qū)分抗體依賴性及抗體非依賴性B細(xì)胞的作用,我們使用了 IgH_(μγl)轉(zhuǎn)基因DBA/2小鼠,這些小鼠僅有IgM~(hi)IgD-的B細(xì)胞,沒有IgMloIgDhi的B細(xì)胞,血液中檢測(cè)不到IgM或IgG的分泌。即這些小鼠B細(xì)胞有抗原提呈作用,但是沒有抗體的分泌。我們使用與臨床移植相似的主要組織相容性復(fù)合物匹配,僅次要組織相容性復(fù)合物不匹配的DBA/2到BALB/c的鼠的慢性GVHD模型,探討B(tài)細(xì)胞以及抗體在慢性GVHD中的致病機(jī)制。這項(xiàng)研究將為慢性GVHD的發(fā)病提供新的觀點(diǎn),并為慢性GVHD治療的新方法提供新的科學(xué)基礎(chǔ)。方法1、小鼠:野生型DBA/2,BALB/C雄性小鼠購買于美國(guó)國(guó)家腫瘤研究所(National Cancer Institute,NCI)。將 IgH_(μγl) BALB/C 小鼠(Dr.Rajewski 惠贈(zèng))與WTDBA/2小鼠進(jìn)行交配,反復(fù)交配十代。十代后,再將產(chǎn)生的雜合子IgH_(μγl)小鼠互相交配,使用PCR方法篩選出純合子IgH_(μγl) DBA/2小鼠。再用流式細(xì)胞分選儀及ELISA對(duì)篩選出的純合子IgH μγl DBA/2小鼠進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。純合子的小鼠僅有表達(dá)IgM~(hi)IgD-B細(xì)胞,沒有IgM loIgDhi B細(xì)胞,且血清中檢測(cè)不到IgM或IgG。小鼠飼養(yǎng)在美國(guó)希望之城國(guó)家醫(yī)學(xué)中心的無菌的動(dòng)物房。2、移植和GVHD的誘導(dǎo):我們使用主要組織相容性復(fù)合物匹配,僅次要組織相容性復(fù)合物不匹配的DBA/2到BALB/c的鼠的cGVHD模型。BALB/c小鼠在移植前八小時(shí),給予致死劑量的Cs137全身照射(850 cGy TBI)。八小時(shí)候后實(shí)驗(yàn)組給予IgH_(μγl)DBA/2 CD25~+ T細(xì)胞清除的脾細(xì)胞(CD25~+ T cell depleted spleen,CD25--SPL)(75X 10~6)或(25X 10~6),加 T 細(xì)胞清除的骨髓細(xì)胞(T cell depleted BM,TCD-BM)(5 X 10~6);或者給予 WT DBA/2 CD25--SPL(75 X 10~6)或(25 X 10~6),加(5 X 10~6)TCD-BM。對(duì)照組給予WT DBA/2 TCD-BM(5X10~6);脾臟中CD25~+T細(xì)胞的清除及骨髓中T細(xì)胞的清除先使用 Biotin 結(jié)合的 anti-CD25,Biotin 結(jié)合的 anti-CD4,Biotin 結(jié)合的 anti-CD8,隨后使用anti-bition-微磁珠。然后用autoMACS細(xì)胞分選器或細(xì)胞分選柱對(duì)其進(jìn)行分選,清除純度達(dá)到99%以上。高劑量IgH_(μγl)組,低劑量IgH_(μγl)組,高劑量WT組,低劑量WT組,TCD組共五組,且每組小鼠各8只。移植后的受體監(jiān)測(cè)弓背,脫毛,腹瀉,體重下降,生存,蛋白尿等GVHD指標(biāo)。3、組織的收集及細(xì)胞懸液的制備:小鼠用CO_2窒息法處死,收集小鼠的脾臟,外周淋巴結(jié),胸腺,皮膚,肝臟和肺臟對(duì)其淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。小鼠的脾臟,外周淋巴結(jié),胸腺的淋巴細(xì)胞懸液通過70μm過濾器研磨過濾制備而成。小鼠的皮膚,先將皮膚剪成小片,放入皮膚消化液1(2-3mg/mlDispase+PBS)中37度轉(zhuǎn)震蕩45分鐘。后轉(zhuǎn)移到皮膚消化液2(RPMI +青/鏈霉素+ 66ug/ml Liberase TM+100ug/mgDNAsel +0.5mg/ml hyaluronidase +2%FBS)中37度轉(zhuǎn)震蕩90分鐘。震蕩結(jié)束后,加入含有EDTA的2%BSA的PBS終止消化。通過70μm過濾器過濾后,用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。小鼠的肺臟,先將含有25ul的膠原酶D和25ulDNAseI的完全培養(yǎng)基注入肺臟,消化30-45分鐘。消化完后,用含有EDTA的2%BSA的PBS終止消化。通過70μm過濾器過濾后,用淋巴細(xì)胞分離液分離肺臟淋巴細(xì)胞。小鼠的肝臟用含有EDTA的2%BSAPBS進(jìn)行研磨,制備成單細(xì)胞懸液。再用淋巴細(xì)胞分離液分離肝臟淋巴細(xì)胞。使用4激光MOFLO Cyan流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),使用Flow Jo軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4、組織的收集及病理分析:小鼠用CO_2窒息法處死,收集小鼠的皮膚,肝臟,肺臟,唾液腺進(jìn)行組織病理分析。小鼠的皮膚收集,先將小鼠皮膚上的毛發(fā)剃去,在小鼠背頸部切下約3cm x 5cm大小的皮膚。將皮膚面向上,肌肉面向下置于biowrap上,將皮膚在biowrap上輕輕地展開。用Surgipath Biowraps將皮膚標(biāo)本包裹起來,放入病理組織盒中,并將病理組織盒放入福爾馬林中浸泡。將唾液腺和肝臟取下,直接放入病理組織盒中,并將病理組織盒放入福爾馬林中浸泡。小鼠肺臟的收集,將3ml的福爾馬林通過氣管注入肺臟,使肺臟完全充盈起來。將肺臟放入病理組織盒中,并將病理組織盒放入福爾馬林中浸泡。然后將小鼠的唾液腺、皮膚、肺臟、肝臟的組織標(biāo)本用石蠟包埋,制備成切片,用HE染色。制備好的HE切片用奧林巴斯顯微鏡觀察并采集圖像。5、組織的收集以及免疫熒光染色:皮膚、脾臟的冰凍組織直接包埋在最佳切割溫度復(fù)合物(optimal cutting temperature compound,OCT compound)中,用干冰快速凍結(jié),儲(chǔ)存在-80度。胸腺的冰凍組織先放入多聚甲醛(Paraformaldehyde Solution,PFA)中4度過夜,24小時(shí)候后轉(zhuǎn)移到蔗糖中4度過夜,使其完全沉淀,48小時(shí)候后轉(zhuǎn)移到OCT compound固定,用干冰快速凍結(jié),儲(chǔ)存在-80度中。對(duì)受體皮膚及胸腺IgG免疫復(fù)合物的沉積,胸腺的胸腺上皮細(xì)胞,脾臟組織B細(xì)胞的生發(fā)中心以及IL23的分泌進(jìn)行免疫熒光染色。免疫熒光染色完成后,切片用奧林巴斯熒光顯微鏡觀察并采集圖像。采集完的圖像用Adobe Photoshop 7.0軟件分析。6、實(shí)時(shí)定量PCR:引物如下:CCL20,正向,5,-CACTCGGTCGTCATGGGT-3',反向,5'-CATCTTCTTGACTCTTAGGCT-3';IL23,正向,5'-TATCCAGTGTGAAGATGGTTGTG-3' 反向,5'-CACTAAGGGCTCAGTCAGAGTTG-3';IL6,正向,5 '-A A G A A AT G AT G G AT G C T A C C-3',反向,5 '-GAAGGACTCTGGCTTTGTC-3';B 7 H1,正向,5'-CAGAAGCTGAGGTAATCTGGA-3,,反向,5'-TGAGTCCTGTTCTGTGGAGG-3';GAPDH,正向,5'-TCACCACCATGGAGAAGGC-3,,反向,5,-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3,。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有的數(shù)據(jù)用GraphPad軟件分析(Prism Version 5.0;GraphPad Software,San Diego,C.A).小鼠死亡為生存分析的終點(diǎn)事件,定量數(shù)據(jù)的結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SEM)表示。定量數(shù)據(jù)多組間的比較用方差分析及基于方差分析的多重比較(LSD檢驗(yàn))。P值0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、我們的課題成功地建立了IgH_(μγl) DBA/2小鼠。通過IgH_(μγl) BALB/c小鼠與DBA/2雜交十代后,我們成功地獲得純合子的IgH_(μγl)DBA/2小鼠,該純合子的小鼠僅有表達(dá)IgMhi IgD-B細(xì)胞,沒有IgMloIgDhi B細(xì)胞,且血清中檢測(cè)不到IgM或 IgG。2、接受IgH_(μγl)供者移植物的受者發(fā)展短暫的慢性GVHD。接受TBI放療的BALB/C小鼠給予IgH_(μγl) DBA/2供者或WTDBA/2供者高劑量(75 x10~6)或低劑量(25x10~6)CD25~+T-清除(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞-清除)的脾臟細(xì)胞和TCD-BM。僅給予TCD-BM的受體很健康,給予高劑量和低劑量WT DBA/2 CD25--SPL的受體發(fā)生嚴(yán)重的蛋白尿以及皮膚慢性GVHD。給予高劑量WT DBA/2 CD25--SPL的受體在移植后35天左右,全部死于蛋白尿和腹水。75%的低劑量WTDBA/2 CD25--SPL的受體可以生存到移植后60天,但是他們?nèi)堪l(fā)生皮膚GVHD。對(duì)比之下,高劑量或低劑量IgH_(μγl) DBA/2 CD25--SPL的受體均沒有出現(xiàn)蛋白尿,并可長(zhǎng)期存活至移植后60天。雖然給予低劑量IgHμγ1 DBA/2 CD25--SPL的受體僅表現(xiàn)輕微的慢性GVHD,但是給予高劑量IgH μγl DBA/2 CD25--SPL的受體在移植后40天左右出現(xiàn)皮膚GVHD,并于移植后60天恢復(fù)。且病理結(jié)果顯示給予高劑量IgH_(μγl) DBA/2 CD25--SPL的受體于移植后40天左右除了肺臟,出現(xiàn)皮膚,唾液腺及肝臟的損害,并于移植后60天恢復(fù)。這些結(jié)果顯示:除了肺臟,供者B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生對(duì)于慢性GVHD的發(fā)生不是必須的,但是對(duì)于慢性GVHD的維持卻是必須的。3、供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體導(dǎo)致淋巴細(xì)胞消減以及淋巴濾泡和生發(fā)中心的破壞。移植后40天及60天,與低劑量WT組相比,低劑量及高劑量的IgH_(μγl)組脾臟及外周淋巴結(jié)供者CD4~+T細(xì)胞的產(chǎn)量明顯升高,且GVHD靶器官供者CD4~+T細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少(P0.05)。在移植后40天和60天,給予高劑量或低劑量IgH_(μγl) DBA/2 CD25--SPL的受體均有很好的淋巴濾泡和GC的形成。然而給予低劑量WTDBA/2 CD25--SPL的受體,淋巴濾泡和GC發(fā)生嚴(yán)重的破壞。流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果免疫熒光結(jié)果一致,在移植后40天和60天,T濾泡輔助細(xì)胞的百分比三組間有顯著區(qū)別(F=10.19,P=0.0049;F=28.48,P=0.0001)。進(jìn)一步比較,T濾泡輔助細(xì)胞的百分比在低劑量WT組顯著低于低劑量IgH_(μγl)組(P=0.0017;P=0.0005)和高劑量 IgH μγl 組(P=0.0155;P0.0001)。同樣,在移植后40天和60天生發(fā)中心B細(xì)胞的百分比三組間也有顯著區(qū)別(F=11.24,P=0.0036;F=19.18,P=0.0006)。進(jìn)一步比較在低劑量WT組也顯著低于低劑量 IgHμγ1 組(P=0.0030;P=0.0004)和高劑量 IgH_(μγl) 組(P=0.0024;P=0.0005)。這些結(jié)果顯示:供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體導(dǎo)致淋巴濾泡和生發(fā)中心的破壞,并導(dǎo)致淋巴組織中淋巴細(xì)胞減少。4、供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體導(dǎo)致胸腺的破壞。移植后40天及60天,CD4~+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞的比例在三組間有顯著區(qū)別(F=44.07,P0.0001;F=26.84,P=0.0002)。給予高劑量和低劑量IgH_(μγl)脾細(xì)胞的受體中,CD4~+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞的比例與給予TCD-BM的受體相似,大于80%。然而給予低劑量WT脾細(xì)胞的受體,CD4~+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞的比例小于20%。同樣移植后40天及60天,CD4~+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞的產(chǎn)量在三組間也有顯著區(qū)別(F=7.08,P=0.0142;F=45.00,P0.0001)。低劑量WT組CD4~+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞的產(chǎn)量顯著低于高劑量IgH_(μγl)組(P=0.0149;P=0.0002)和低劑量IgH_(μγl) 組(P=0.0071;P0.0001)。胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞免疫熒光顯示,給予IgH_(μγl)供者脾臟細(xì)胞的受體胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞沒有破壞,但是給予WT供者脾臟細(xì)胞的受體,胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞破壞嚴(yán)重。這些結(jié)果顯示供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體在慢性GVHD中導(dǎo)致胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞的破壞。5、供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以導(dǎo)致Th17細(xì)胞在淋巴器官和GVHD靶器官的擴(kuò)增。移植后40天及60天,給予IgH_(μγl)脾細(xì)胞的受體和給予WT脾細(xì)胞的受體,在脾臟細(xì)胞中Th17的比例沒有區(qū)別。不同的是,移植后40天及60天,給予低劑量IgH_(μγl)脾細(xì)胞的受體外周淋巴結(jié)中Th17的比例顯著低于給予低劑量WT脾細(xì)胞受體(P=0.0164;P=0.0003)。雖然移植后40天,在接受IgH_(μγl)脾細(xì)胞的受體和接受WT脾細(xì)胞的受體皮膚組織中有很少的Th17細(xì)胞。但在移植后60天,給予WT脾細(xì)胞的受體,皮膚組織中Th17細(xì)胞的比例要顯著高于給予高劑量IgH_(μγl)脾細(xì)胞的受體(P=0.0002)和給予低劑量IgH_(μγl)脾細(xì)胞的受體(P=0.0001)。這些結(jié)果顯示,B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體導(dǎo)致移植早期Thl7在淋巴結(jié)的擴(kuò)增以及移植后期Th17在皮膚組織的擴(kuò)增相關(guān)。6、我們觀察到移植后40天,與低劑量IgH~(μYl)DBA/2CD25-SPL受體相比,在外周淋巴結(jié)以及皮膚,低劑量WT DBA/2 CD25-SPL受體及高劑量IgH_(μγl) DBA/2CD25-SPL受體有較高比例的CD11c~+CD11b~-的樹突狀細(xì)胞(P0.01)。免疫熒光也顯示出,在外周淋巴結(jié)以及皮膚,低劑量WTDBA/2CD25-SPL受體及高劑量IgH_(μγl) DBA/2 CD25-SPL受體有較高比例的CD11c~+CD11b~-的樹突狀細(xì)胞(P0.01)。而且,在外周淋巴結(jié)以及皮膚,與低劑量IgH_(μγl) DBA/2CD25-SPL受體相比,低劑量WTDBA/2CD25-SPL受體分泌更多的IL-23。(P0.05)。這些結(jié)果顯示:供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體在外周淋巴結(jié)及皮膚組織刺激樹突狀細(xì)胞分泌IL-23,從而導(dǎo)致Th17細(xì)胞的擴(kuò)增。7、我們發(fā)現(xiàn)移植后40天,免疫組化顯示:對(duì)比低劑量WTDBA/2CD25-SPL受體,低劑量IgH_(μγl) DBA/2 CD25-SPL受體皮膚組織B7H1的表達(dá)增強(qiáng)。與之一致的是:熒光定量PCR顯示:皮膚組織中B7H1mRNA表達(dá)水平也升高(P0.01)。而且,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)低劑量IgH_(μγl) DBA/2CD25-SPL受體,皮膚組織中樹突狀細(xì)胞也上調(diào)B7H1的表達(dá)(P0.01)。這些結(jié)果顯示供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體導(dǎo)致皮膚組織下調(diào)B7H1的表達(dá),從而增強(qiáng)慢性GVHD的發(fā)生。結(jié)論1、供者B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體導(dǎo)致胸腺的破壞、外周淋巴細(xì)胞消減、濾泡及生發(fā)中心的破壞。2、供者Thl細(xì)胞與早期皮膚cGVHD的發(fā)生相關(guān),而供者Thl7細(xì)胞與晚期皮膚cGVHD的發(fā)生及持續(xù)的皮膚GVHD的發(fā)生相關(guān)。3、供者B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,抗體沉積于皮膚組織,刺激DC分泌IL-23以及單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-6。導(dǎo)致組織釋放CCL20增加,增強(qiáng)Thl7細(xì)胞遷移至皮膚組織,與此同時(shí),增加的IL-6以及降低的IFN-γ,導(dǎo)致B7H1表達(dá)的下調(diào),使得慢性GVHD持續(xù)的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R457.7

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本文編號(hào)：1397537