發(fā)布時(shí)間：2018-01-07 11:02

  本文關(guān)鍵詞：凝血酶的新型適配體—懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)及作用機(jī)制研究　出處：《天津大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：核酸適配體由于其具有分子量小、制備簡(jiǎn)單、高親和力、高特異性等多種優(yōu)點(diǎn),逐漸替代抗體作為一種新型的生物識(shí)別元件,有望廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、檢測(cè)分析和臨床診斷等諸多領(lǐng)域。懸浮芯片技術(shù)是一種高通量、低背景的生物芯片技術(shù),以熒光編碼微球作為檢測(cè)探針載體進(jìn)行靶標(biāo)物的快速靈敏檢測(cè)。本研究將適配體與懸浮芯片技術(shù)相結(jié)合,以經(jīng)典模式靶標(biāo)物凝血酶作為檢測(cè)目標(biāo),建立高親和力和高特異性的適配體-懸浮芯片檢測(cè)新技術(shù)。將氨基化的15mer的適配體(Thrombin binding aptamer 1,TBA1)修飾在磁性羧基化微球表面制備成探針微球,用于捕獲溶液和血液樣品中的凝血酶,生物素化的29mer的適配體(Thrombin binding aptamer 2,TBA2)作為報(bào)告探針與凝血酶結(jié)合,形成在微球上穩(wěn)定的三明治夾心復(fù)合物,經(jīng)過(guò)磁分離,將此復(fù)合物與溶液中未偶聯(lián)靶標(biāo)物分離。通過(guò)鏈霉親和素-生物素的反應(yīng)系統(tǒng)將熒光報(bào)告蛋白鏈霉親和素-藻紅蛋白(Strepavidin-phycoerythrin,SA-PE)連接到報(bào)告探針TBA2上,由懸浮芯片系統(tǒng)檢測(cè)得到中位熒光強(qiáng)度值(Median Fluorescence Intensity,MFI)。通過(guò)優(yōu)化,獲得了最佳檢測(cè)孵育條件和最佳偶聯(lián)方案。在最佳檢測(cè)條件和偶聯(lián)方案下,建立了凝血酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),檢測(cè)范圍18.37-554.31 nM(IC10-IC90)最低檢出限為5.4 nM,說(shuō)明檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度和精確度。經(jīng)過(guò)特異性測(cè)定實(shí)驗(yàn)證明了適配體-懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)凝血酶具有良好的特異性。對(duì)人血清中進(jìn)行凝血酶加標(biāo)回收率的測(cè)定,加標(biāo)回收率在82.6-114.2%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以?xún)?nèi),獲得了滿(mǎn)意的回收率效果,該檢測(cè)技術(shù)有望成功應(yīng)用于臨床診斷的高通量樣品檢測(cè)。在建立適配體-懸浮芯片檢測(cè)新技術(shù)的同時(shí),對(duì)TBAs與凝血酶之間的分子間相互作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。利用微量熱泳動(dòng)技術(shù)(Microscale thermophoresis,MST)證實(shí)TBAs與凝血酶間具有很高的親和力。MST信號(hào)反映了TBA1與凝血酶的偶聯(lián)模式,表明TBA1可同時(shí)結(jié)合纖維蛋白原和肝素位點(diǎn)。本研究將新型識(shí)別元件——適配體與靈敏的懸浮芯片技術(shù)相結(jié)合,建立了適配體-懸浮芯片檢測(cè)新技術(shù),初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)人血清樣本中凝血酶的分析,方法靈敏、特異和快速,展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。利用MST技術(shù)分析適配體與凝血酶間的相互作用,為深入探究適配體與靶標(biāo)物的識(shí)別偶聯(lián)機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也可為藥物靶向性和藥物作用機(jī)制等的研究提供一定的數(shù)據(jù)支持。
[Abstract]:Aptamer due to its small molecular weight, simple preparation, high affinity, high specificity and other advantages, gradually replace the antibody as a new biological recognition element, is expected to be widely used in life science research, detection and analysis of clinical diagnosis and many other fields. Suspension array technology is a high-throughput biological. Chip technology, low background, rapid and sensitive detection of targets using fluorescent microspheres as detection probe vector encoding. This study will aptamer and suspension chip technology combined with classic model of target thrombin as detection target, new technology of aptamer suspension chip detection to establish high affinity and high specificity of the amino. The 15mer aptamer (Thrombin binding aptamer 1, TBA1) in the modified magnetic carboxylated microspheres were prepared by surface probe microspheres, used to capture the blood coagulation enzyme solution and blood samples, biotin Aptamers of 29mer (Thrombin binding aptamer 2, TBA2) report as a combination of probe and thrombin, form stable microspheres sandwich complexes, after magnetic separation, the complex with the solution without coupling target separation. By streptavidin biotin streptavidin fluorescent reporter protein reaction system streptavidin - phycoerythrin (Strepavidin-phycoerythrin, SA-PE) connected to the reporter probe TBA2, median fluorescence intensity values obtained by suspension chip detection system (Median Fluorescence Intensity, MFI). After optimization, the optimal detection of incubation conditions and the best coupling scheme is obtained. In the optimum conditions and the coupling scheme, a thrombin standard detection curve, detection range of 18.37-554.31 nM (IC10-IC90) the lowest detection limit was 5.4 nM, that method has high detection sensitivity and accuracy. After a specific test The experiment proved that the aptamer fixed suspension chip detection of thrombin has good specificity of thrombin. Spiked recovery tests performed in human serum, the recovery rate was 82.6-114.2%, the relative standard deviation is less than 10%, the recovery rate obtained satisfactory effect, high-throughput sample detection the detection technology is expected to be successful applied to the clinical diagnosis. In the establishment of the aptamer and new detection technology of suspension array, between TBAs and thrombin on the molecular interaction mechanism was discussed. The use of trace thermophoresis Technology (Microscale thermophoresis MST) has confirmed the high affinity.MST signal reflects the coupling model of TBA1 and thrombin TBAs with thrombin showed that TBA1 can at the same time, fibrinogen and heparin binding sites. This research will be the new recognition element, aptamer and suspension chip technology sensitive combination Together, established a new technique for the detection of aptamer suspension chip, realized the analysis of thrombin in human serum samples method is sensitive, specific and rapid, show a good application prospect. The analysis suitable ligand interaction between thrombin and the use of MST technology, laid the foundation for further exploration of the coupling mechanism and aptamer recognition target, also can provide the data support for targeted drug research and drug action mechanism.

【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R446.1

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