發(fā)布時間：2018-01-01 20:25

  本文關(guān)鍵詞：Notch重組配體D1R在促進(jìn)造血重建中的作用與機理　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：當(dāng)罹難者意外暴露于不同劑量電離輻射時,如何治療輻射誘發(fā)的急慢性骨髓損傷是當(dāng)今局部戰(zhàn)爭時代的一個重要課題。外界各種應(yīng)激性刺激包括氧化應(yīng)激、貧血、缺氧刺激、電離輻射、毒性化學(xué)藥物以及炎癥刺激等,容易損傷造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC),進(jìn)而擾亂造血穩(wěn)態(tài)、損害造血重建。其中被廣泛應(yīng)用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤或者實體瘤的放療和高劑量化療,也會引起骨髓以及造血微環(huán)境的損害,導(dǎo)致造血干細(xì)胞數(shù)量減少、殘存HSC功能缺陷,限制HSC的再生能力和分化潛能,阻礙造血恢復(fù)。目前臨床上主要通過各種造血生長因子如G-CSF、IL-11、TPO以及EPO等刺激造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)增殖和分化以緩解急性骨髓抑制。但是,對于骨髓損傷后造血重建過程的發(fā)生發(fā)展以及機理機制仍知之甚少。已有研究表明,諸多參與調(diào)控造血穩(wěn)態(tài)的信號通路如Notch信號途徑、凋亡信號、TGF-β信號通路、細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等,也參與了造血重建的過程,并且受骨髓微環(huán)境內(nèi)脈管系統(tǒng)的部分調(diào)節(jié)。對科研工作者而言,造血微環(huán)境niche的神秘性已持續(xù)多年,大量科學(xué)研究旨在揭示niche的細(xì)胞成分和分子調(diào)控機制。近年來隨著分子影像和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)不同類型的血管龕參與骨髓損傷后造血靜息態(tài)、細(xì)胞增殖以及骨髓重建之間的平衡和調(diào)控。目前已明確造血干細(xì)胞龕的主要組成細(xì)胞包括血管周細(xì)胞、骨髓竇狀內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoid endothelial cells,SECs)、成骨細(xì)胞、交感神經(jīng)、非髓鞘性施旺細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等。同時,造血微環(huán)境中一系列復(fù)雜的可溶性調(diào)控元件、內(nèi)源性的信號通路以及受粘附分子、局部氧分壓、其他細(xì)胞niche相互串話調(diào)控的微環(huán)境信號通路等,對造血干細(xì)胞的維持具有重要意義。參與其中的分子成分主要有血管周細(xì)胞相關(guān)的SCF/CXCL12信號軸、復(fù)雜但作用不明確的Wnt信號通路和Notch信號通路、鈣黏蛋白N、TGF-β以及niche中的其他組分等。因此,研究并利用干細(xì)胞池內(nèi)的細(xì)胞和環(huán)境因素,尋求新策略促進(jìn)骨髓抑制后造血恢復(fù)具有重要意義。已有研究表明,在脊椎動物發(fā)育過程中,高度保守的Notch信號通路對維持胚胎發(fā)育期HSC的發(fā)生必不可少,同時在各系造血細(xì)胞發(fā)育過程中Notch也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。Notch信號需要相鄰細(xì)胞間Notch配體與受體直接接觸才能被激活。前期研究發(fā)現(xiàn),Notch受體廣泛表達(dá)于造血干細(xì)胞及其子代細(xì)胞,Notch配體則高表達(dá)于骨髓造血微環(huán)境中,這為在骨髓造血龕中特異性激活Notch信號提供可能。在早期造血調(diào)控過程中,Notch受體在造血細(xì)胞中的表達(dá)情況決定著細(xì)胞分化命運,特定的造血祖細(xì)胞會按Notch預(yù)設(shè)的路徑進(jìn)行分化,比如Notch1能促進(jìn)T細(xì)胞和巨核細(xì)胞的產(chǎn)生,Notch2則決定紅系祖細(xì)胞的分化。雖然已明確Notch信號能在體外調(diào)節(jié)HSC的自我更新和分化,但是經(jīng)典Notch信號途徑調(diào)控體內(nèi)造血干細(xì)胞維持以及Notch信號是否必不可缺仍存在爭議。其原因在于:1、Notch信號自身具有復(fù)雜性;2、體內(nèi)環(huán)境錯綜復(fù)雜;3、方法學(xué)上缺乏有效的研究和評估手段。因此,尋找新技術(shù)促進(jìn)HSC體內(nèi)擴增,利用造血微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞和調(diào)控因子維持造血干細(xì)胞的 干性‖,避免惡性轉(zhuǎn)化,對于支持臨床藥物開發(fā)最終實現(xiàn)造血快速恢復(fù)具有重要意義。本課題擬通過基因修飾小鼠骨髓抑制模型,明確Notch信號途徑對骨髓損傷后應(yīng)激造血的調(diào)控作用;研發(fā)新型內(nèi)皮靶向Notch信號激活劑m D1R重組蛋白,在細(xì)胞和分子水平確認(rèn)蛋白活性后,從整體動物水平評估Notch活化配體m D1R在電離輻射以及化學(xué)藥物所致骨髓抑制模型中的生物學(xué)效應(yīng);結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等手段,對Notch信號通路調(diào)控應(yīng)激造血損傷后骨髓重建的分子機制進(jìn)行探討。主要研究結(jié)果如下:1、Notch信號缺失不利于造血系統(tǒng)損傷再修復(fù)利用骨髓特異性剔除RBP-J遺傳修飾小鼠急性電離輻射損傷模型,發(fā)現(xiàn)Notch信號通路是骨髓損傷再修復(fù)過程中的重要調(diào)控通路,證實Notch信號以正調(diào)節(jié)子身份參與骨髓損傷后造血再生和譜系分化命運的調(diào)控。2、新型Notch激活劑m D1R能挽救骨髓抑制,促進(jìn)造血干細(xì)胞以及髓系細(xì)胞重建將Notch配體Delta like 1的DSL結(jié)構(gòu)域和整合素分子αVβ3特異性配體RGD九肽相融合,表達(dá)出新型內(nèi)皮細(xì)胞靶向的Notch信號激活劑——重組蛋白m D1R。在電離輻射以及化學(xué)藥物誘導(dǎo)野生小鼠多種骨髓損傷模型中,證實m D1R具有體內(nèi)激活Notch信號、挽救骨髓損傷、造血動員、促進(jìn)髓內(nèi)外造血重建、擴增造血干祖細(xì)胞尤其長期造血干細(xì)胞、傾向性促進(jìn)髓系造血快速恢復(fù)的生物學(xué)效應(yīng)。3、m D1R挽救骨髓損傷具有劑量相關(guān)性利用野生小鼠急性電離輻射骨髓損傷模型,證實m D1R促造血重建作用具有劑量相關(guān)性,摸索出m D1R的最佳劑量范圍,發(fā)現(xiàn)其具有濃度過低無效、濃度過高抑制的特點,對未來用藥具有指導(dǎo)意義。4、m D1R與G-CSF無協(xié)同效應(yīng)對接受急性電離輻射的野生小鼠聯(lián)合應(yīng)用m D1R以及經(jīng)典升白藥物G-CSF,發(fā)現(xiàn)二者具有相似的髓系擴增能力,但不具有協(xié)同升白效應(yīng);同時證實m D1R更利于輻照后造血干祖細(xì)胞恢復(fù),提示內(nèi)皮靶向Notch信號激活劑m D1R可能具有更廣闊的應(yīng)用前景。5、m D1R在小鼠體內(nèi)無毒副作用在前期已證實m D1R對小鼠主要臟器無毒副作用的基礎(chǔ)上,著重觀察了輻照損傷模型小鼠停藥后3個月和6個月造血系統(tǒng)的各項指標(biāo),發(fā)現(xiàn)短期應(yīng)用m D1R重組蛋白小鼠髓內(nèi)外造血重建良好,未見血液系統(tǒng)以及實體器官惡性轉(zhuǎn)變,與正常小鼠基本無差別;在化學(xué)藥物損傷模型中,血液系統(tǒng)快速重建后的復(fù)原時間則更短(僅為14天),確保了m D1R作為一種新型轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)藥物的使用安全性。6、Notch信號上調(diào)CSF2RB2表達(dá),激活STAT3生存信號通路利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選以及體內(nèi)外實驗證實,m D1R激活Notch信號途徑后能顯著上調(diào)Csf2rb2轉(zhuǎn)錄本表達(dá);報告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗從基因調(diào)控水平證實,ICN1能識別Csf2rb2啟動子序列的RBP-J結(jié)合位點,有效激活Csf2rb2基因表達(dá),進(jìn)而活化Notch下游STAT3/Erk生存信號通路,這與m D1R抑制造血干祖細(xì)胞凋亡而不影響細(xì)胞增殖的細(xì)胞學(xué)機制相互映證。7、臨床證實Notch信號與造血干細(xì)胞移植預(yù)后存在正相關(guān)性利用免疫熒光染色以及實時定量PCR證實,臨床上實施造血干細(xì)胞移植患者的骨髓重建速度和造血恢復(fù)能力與造血細(xì)胞內(nèi)Notch信號的激活程度呈正相關(guān)性,同時也與造血細(xì)胞CSF2RB基因表達(dá)水平呈現(xiàn)部分相關(guān)性,為未來判斷預(yù)后以及研發(fā)新藥提供了可靠依據(jù)。綜上所述,本研究獨創(chuàng)性的提出Notch信號以正調(diào)節(jié)子的身份參與了放化療誘導(dǎo)骨髓抑制后造血干細(xì)胞重建以及髓系重建,為后續(xù)研發(fā)促進(jìn)骨髓抑制患者造血重建的新型輔助用藥奠定了基礎(chǔ),主要結(jié)論如下:1、利用遺傳修飾小鼠骨髓抑制模型證實Notch信號途徑參與應(yīng)激造成骨髓抑制后的造血重建。2、課題組自主研發(fā)了靶向骨髓血管龕內(nèi)竇狀內(nèi)皮細(xì)胞的新型Notch信號激活劑,多種模型、多個角度全面證實外源性激活Notch信號有利于骨髓抑制后機體造血干細(xì)胞尤其長期造血干細(xì)胞的維持,實現(xiàn)了短期內(nèi)骨髓快速重建,降低了機體死亡率,緩解了電離輻射和化學(xué)藥物誘發(fā)的長期遺傳毒副作用。3、在體內(nèi)證實D1R具有促進(jìn)造血損傷后髓系重建的生物學(xué)功能,提出Notch信號在造血穩(wěn)態(tài)時不影響髓系分化,但在應(yīng)激損傷時能傾向性促進(jìn)造血干祖細(xì)胞向髓系祖細(xì)胞分化,進(jìn)而快速恢復(fù)髓內(nèi)外粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞數(shù)目,增強機體抵抗感染的能力,獨創(chuàng)性的論證了應(yīng)激造血條件下Notch信號調(diào)控髓系快速恢復(fù)的生物學(xué)效應(yīng)。4、體內(nèi)證實造血損傷早期外源性D1R蛋白通過激活Notch/CSF2RB2/STAT3/Erk信號軸,維持造血干祖細(xì)胞存活,抑制細(xì)胞凋亡,確保后續(xù)骨髓重建的基石。5、在臨床骨髓移植患者體內(nèi)證實Notch信號的激活程度與預(yù)后存在正相關(guān)性。
[Abstract]:In recent years , various hematopoietic growth factors such as G - CSF , IL - 11 , TPO and EPO have been used to stimulate hematopoietic stem cells ( HSC ) . 澶嶆潅浣嗕綔鐢ㄤ笉鏄庣‘鐨刉nt淇″彿閫氳礬鍜孨otch淇″彿閫氳礬,閽欓粡铔嬬櫧N,TGF-尾浠ュ強niche涓殑鍏朵粬緇勫垎絳，

本文編號：1366072