本文關(guān)鍵詞：紅細(xì)胞凍干保存影響因素的初步研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：紅細(xì)胞長期保存是輸血醫(yī)學(xué)中的重要研究課題,凍干法是實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞長期保存的方法之一。早在上世紀(jì)60年代,就有學(xué)者嘗試以凍干的方式保存紅細(xì)胞。至上世紀(jì)90年代,紅細(xì)胞的凍干保存成為低溫生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn),國內(nèi)外的數(shù)個(gè)研究小組對(duì)凍干保護(hù)劑的篩選和凍干、復(fù)水過程等環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量的研究。在此過程中,發(fā)現(xiàn)凍干的紅細(xì)胞總有一部分水難以去除,將這部分水定義為“殘余水分”。殘余水相關(guān)問題是目前紅細(xì)胞凍干保存研究遇到的爭議和瓶頸之一。近年來,發(fā)現(xiàn)甘油作為滲透性保護(hù)劑,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)形成氫鍵,降低了電解質(zhì)的濃度,減少了胞內(nèi)冰的形成,與PVP等非滲透性的保護(hù)劑聯(lián)合使用,保護(hù)效果較好。但是甘油有保濕護(hù)水作用,不利于干燥,這與去除水分又相矛盾,可見對(duì)于保護(hù)劑中甘油與殘余水的問題還有很多工作去做。本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上對(duì)紅細(xì)胞凍干保護(hù)劑中甘油濃度及與殘余水的關(guān)系、凍干紅細(xì)胞殘余水含量測(cè)定方法等問題進(jìn)行了初步研究。目的：本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)保護(hù)劑中甘油濃度、凍干程序(擱板溫度、干燥時(shí)間)及保存時(shí)間與細(xì)胞回收率、溶血率、殘余水含量的關(guān)系進(jìn)行了研究；同時(shí),對(duì)凍干紅細(xì)胞回收率、殘余水含量測(cè)定等技術(shù)方法進(jìn)行了對(duì)比分析,為進(jìn)一步探討紅細(xì)胞凍干殘余水對(duì)紅細(xì)胞凍干保存的影響提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：用不同甘油濃度保護(hù)劑處理紅細(xì)胞,設(shè)置不同擱板溫度及次級(jí)干燥時(shí)間,用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),用計(jì)數(shù)板、全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)紅細(xì)胞,氰化高鐵法測(cè)定血紅蛋白,分析細(xì)胞復(fù)水、洗脫保護(hù)劑恢復(fù)等滲后細(xì)胞回收率、溶血率情況。用熱重法、Karl-Fischer化學(xué)法及其改進(jìn)方法測(cè)定凍干紅細(xì)胞水含量,對(duì)比不同方法的結(jié)果,分析不同保護(hù)劑組的凍干紅細(xì)胞剩余水含量變化情況。結(jié)果：1、本研究所用保護(hù)劑中不同甘油濃度(3%,6%,9%,12%,15%,18%,21%)(w/v)對(duì)紅細(xì)胞凍干保存的影響：各組凍干復(fù)水后的紅細(xì)胞形態(tài)正常,凍干紅細(xì)胞殘余含水量為(11.53±0.33)%～(35.32±1.53)%,細(xì)胞回收率為(51.04±6.14)%～(84.37±8.62)%,細(xì)胞溶血率為(15.86±2.23)%～(43.43±6.51)%。殘余含水量隨甘油濃度的增大而升高,具有很好的相關(guān)性,R2=0.9963；9%,12%,15%三組細(xì)胞復(fù)水回收率、溶血率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.076),細(xì)胞凍干保存效果較好與其余各組之間差異有顯著性(P0.01)。2、不同擱板溫度-60℃,-50℃,-40℃,-30℃組,洗脫保護(hù)劑后細(xì)胞回收率分別為58.50±7.29,22.67±2.10,21.52±1.70,29.73±1.35,細(xì)胞溶血率分別為77.55±3.26,82.31±1.16,85.30±1.35,84.37±0.62,殘余水含量分別為25.18±0.19,22.12±1.46,23.02±1.25,26.19±0.58。當(dāng)擱板溫度為-60℃、次級(jí)干燥時(shí)間為2h時(shí),紅細(xì)胞凍干保存效果最優(yōu),洗脫保護(hù)劑后細(xì)胞回收率、溶血率與其余各組比較差異有顯著性(P0.01)。不延長次級(jí)干燥時(shí)間組(次級(jí)干燥2h),紅細(xì)胞凍干保存效果優(yōu)于延長次級(jí)干燥時(shí)間組(次級(jí)干燥2h后再延長24h),差異有顯著性(P0.01),兩組凍干紅細(xì)胞殘余水含量差異無顯著性,P=0.273。紅細(xì)胞凍干后隨著保存時(shí)間延長,細(xì)胞回收率呈下降趨勢(shì),不同保存時(shí)間段溶血率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3、凍干紅細(xì)胞洗脫保護(hù)劑恢復(fù)等滲后計(jì)數(shù),儀器計(jì)數(shù)結(jié)果為(2.29±0.08)×1012,手工計(jì)數(shù)結(jié)果為(0.71±0.11)×1012,差異有顯著性(P0.01)。Karl-Fischer法、Karl-Fischer聯(lián)合卡式爐法、Karl-Fischer法聯(lián)合質(zhì)量差法及熱重法,測(cè)定凍干紅細(xì)胞剩余水含量百分比分別為(3.20±0.52)%,(6.70±1.22)%,(10.07±0.19)%,(25.18±0.42)%,結(jié)果有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)所用紅細(xì)胞凍干保存保護(hù)劑配方最適甘油濃度為(9-15)%(w/v),最適擱板溫度為-60℃,次級(jí)干燥時(shí)間為2h;3.甘油濃度與殘余含水量具有線性相關(guān)性,可以采用不同甘油濃度來控制殘余水含量;3.熱重法較Karl-Fischer法、KF聯(lián)合質(zhì)量差法及KF聯(lián)合卡式爐法——檢測(cè)殘余含水量結(jié)果偏高；KF聯(lián)合卡式爐法能有效避免樣本溶解不完全問題,測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性高于單純的Karl-Fischer法;4.當(dāng)紅細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí),應(yīng)用計(jì)數(shù)板法測(cè)定凍干紅細(xì)胞回收率,可有效避免損傷細(xì)胞對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性造成干擾。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R457.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1352960