靈芝自古便是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的珍貴藥材,具有滋補強(qiáng)身、扶正固本之效。在靈芝中提取的一些小分子物質(zhì)如蛋白質(zhì),多糖等也有著免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等功效。靈芝蛋白-8（LZ-8）是從靈芝菌絲體中提取出的一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。它的結(jié)構(gòu)與功能與免疫球蛋白相似,具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。因此,LZ-8可作為一種抗腫瘤藥物,有著巨大的研發(fā)潛力。由于野生靈芝提取量低等原因,目前LZ-8的制備大多采用基因工程的方法,即重組靈芝-8（rLZ-8）。rLZ-8作為一種基因工程藥物,其制備已經(jīng)日趨成熟,但到目前為止還沒有一套標(biāo)準(zhǔn),快速的檢測方法。因此,本文采取噬菌體展示技術(shù)篩選rLZ-8配體短肽的方法,建立對rLZ-8蛋白檢測的方法,替代單克隆抗體,實現(xiàn)快速,便捷,實時檢測rLZ-8,為抗腫瘤藥物的檢測提供一種新產(chǎn)品和生物學(xué)檢測方法。本研究首先利用噬菌體展示技術(shù),經(jīng)過四輪篩選,得到與rLZ-8特異性結(jié)合的重組噬菌體。隨機(jī)挑選克隆子進(jìn)行ELISA鑒定并提取其ssDNA,進(jìn)行測序及序列比對,得到一條與rLZ-8特異性結(jié)合較強(qiáng)的多肽L-T-P-H-K-H-H-K-H-L-H-A。合成該多肽,并將該多肽分別進(jìn)行生物素化... 

【文章來源】：長春理工大學(xué)吉林省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（LZ-8蛋白）結(jié)構(gòu)示意圖

第一章緒論6肽庫篩選技術(shù)篩選出rLZ-8蛋白的特異性多肽配體，建立檢測rLZ-8蛋白的方法學(xué)，替代rLZ-8的單克隆抗體。下面，就對本課題所要應(yīng)有的主要技術(shù)做詳細(xì)的介紹。1.3噬菌體展示技術(shù)的研究進(jìn)展1.3.1噬菌體展示技術(shù)的原理噬菌體展示技術(shù)(phagedisplaytechnology)是一種將外源蛋白或多肽與其自身衣殼蛋白進(jìn)行融合表達(dá)并展示在噬菌體表面的技術(shù)[37]。這項技術(shù)是由美國生物學(xué)家SmithGP[38]首次提出的。他將外源的fd基因與絲狀噬菌體M13的次要衣殼蛋白pⅢ基因進(jìn)行連接，得到重組噬菌體，它們進(jìn)行融合表達(dá)，展示在表面，由此建立了這項技術(shù)。在1990年，McCafferty[39]利用噬菌體展示技術(shù)順利得到與對應(yīng)抗原相結(jié)合的抗體片段，建立了噬菌體抗體庫技術(shù)。1996年，生物學(xué)者首次應(yīng)用此技術(shù)進(jìn)行生物體內(nèi)淘選實驗，2018年，此項技術(shù)獲得了諾貝爾化學(xué)獎[40,41]。噬菌體展示技術(shù)的主要原理如圖1.2所示，首先將靶蛋白分子包被在板上，用構(gòu)建多樣的噬菌體肽庫與靶蛋白之間進(jìn)行共同孵育，洗去未結(jié)合的噬菌體，將與之結(jié)合下來的噬菌體洗脫下來，將洗脫下來的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)過3~4輪這樣生物淘選的過程，與靶蛋白特異性結(jié)合，親和力高的重組噬菌體就進(jìn)行了富集。提取出這些噬菌體的DNA，將其進(jìn)行測序，進(jìn)一步對其進(jìn)行深入的研究。外源多肽或蛋白展示在噬菌體的表面,而對應(yīng)編碼的基因作為噬菌體重組基因，可以通過DNA測序而確定出它們的序列。該技術(shù)的顯著特點就是建立了基因型和表現(xiàn)型之間的相統(tǒng)一的關(guān)系[42,43]。圖1.2噬菌體展示技術(shù)的基本原理流程圖

第一章緒論71.3.2絲狀噬菌體展示系統(tǒng)目前應(yīng)用最多的噬菌體展示系統(tǒng)有λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)、T7噬菌體展示系統(tǒng)和絲狀噬菌體展示系統(tǒng)[44]。但目前應(yīng)用最多的是絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，已開發(fā)出商品試劑盒。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)主要是以噬菌體M13作為主要的展示對象，M13噬菌體的結(jié)構(gòu)如圖1.3所示。M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，內(nèi)部含有一個單鏈的環(huán)狀ssDNA分子，由6407bp核苷酸組成，其含有噬菌體擴(kuò)增和單鏈DNA復(fù)制所需要的所有遺傳信息[45]。M13是一種溶源性噬菌體，可以侵染大腸桿菌，并利用其ssDNA在大腸桿菌內(nèi)的滾環(huán)復(fù)制進(jìn)行數(shù)量上的擴(kuò)增，且擴(kuò)增后不會裂解宿主菌，因而可簡化后續(xù)操作，得到純化的噬菌體[35]。2012年，陳興龍[46]等將赭曲霉毒素A(OTA)模擬抗原表位展示在絲狀噬菌體的主要蛋白pⅧ表面，獲得無毒、容易制備的OTA競爭抗原替代物，建立了檢測OTA的ELISA檢測方法。2017年，張起瑩[47]等利用噬菌體十二肽庫篩選技術(shù)篩選出與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的多肽配體，并建立了增強(qiáng)比濁法來檢測內(nèi)毒素，代替了天然鱟試劑，為內(nèi)毒素的檢測提供了一種檢測方法。圖1.3所示絲狀噬菌體M13結(jié)構(gòu)示意圖1.3.3噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用

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本文編號：3341800